Method Article
Для проверки взаимодействия белка с его целевым липидного мы использовали MACS и Аннексин V-сопряженных магнитных гранул и липидных везикул синтезируется из липидных цели и Аннексин V-связывающих фосфатидилсерина. Белки связаны с целевой липидного совместно очищенный и проанализированы после элюирования из бисера.
Анализ липидного взаимодействия белка трудно, потому что липиды встраиваются в клеточные мембраны и, следовательно, недоступными для большинства процедур очистки. В качестве альтернативы, липиды могут быть покрыты на плоских поверхностях, который используется для липидного ИФА и Plasmon резонансной спектроскопии. Тем не менее, липидов поверхности покрытия не образуют микродоменной структуры, которые могут иметь важное значение для липидного связующие свойства. Кроме того, эти методы не позволяют для очистки больших количеств белков привязки к их липидов цели.
Чтобы преодолеть эти ограничения тестирования взаимодействия липидных белка и очистить липидного связывающих белков, мы разработали новый метод называют липидные пузырьки-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных активированных сортировки клеток (LIMACS). В этом методе, липидные пузырьки готовы с целевой липидного и фосфатидилсерина, как якорь для липидного Аннексин V MACS. Фосфатидилсерин является вездесущий фосфолипид клеточных мембран, который показывает высокое сродство к Аннексин белка В. Использование магнитных шариков конъюгированных с Аннексин V фосфатидилсерина содержащих пузырьки липидного будет связываться с магнитных бус. Когда липидные пузырьки инкубируют с Клеточный лизат связывание белка с целевой липидного также будет связан с бисером и могут быть совместно очищают, используя MACS. Этот метод может также использоваться для проверки, если рекомбинантных белков восстановить белковый комплекс привязки к целевой липидов.
Мы использовали этот метод, чтобы показать взаимодействие атипичной PKC (aPKC) с сфинголипида церамида и сотрудничать очистить простаты апоптоз ответ 4 (PAR-4), связывание белка с церамида связанных aPKC. Мы также использовали этот метод для воссоздания церамида связанных комплекс рекомбинантного aPKC с клеточной полярности связанных белков Par6 и Cdc42. С липидные пузырьки могут быть подготовлены с различными sphingo или фосфолипиды, LIMACS предлагает универсальный тест на липид-белковых взаимодействий в липидных среды, которая напоминает, что тесно клеточной мембраны. Дополнительная белковых комплексов липид можно получить, используя протеомики анализ липидного связывающий белок совместно с очищенной липидных везикул.
1. Введение
Липидных везикул-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных активированной сортировки клеток (LIMACS) техника была разработана в нашей лаборатории, чтобы изолировать церамида связанных белковых комплексов 1-3. Изначально липидные пузырьки были сделаны из керамидов и фосфатидилсерина, что позволило MACS с использованием магнитных частиц, конъюгированных Аннексин V (высоко аффинных к фосфатидилсерина), чтобы изолировать пузырьки и связанных с ними белков. Мы использовали технику для LIMACS в пробирке восстановление церамида связанных комплекс полярности и изоляции церамида-связывающих белков из клеточных лизатов 3. LIMACS можно изменить с помощью других партнеров по взаимодействию для выделения пузырьков (например, гликолипидов-лектины, специфические или липидных антител).
2. Экспериментальные процедуры
Подготовка липидные пузырьки и aPKCBinding Анализы
В пробирке липид-белковых комплекса полярности
3. Результаты
LIMACS очистки PKCζ-EGFP и церамида связывающий домен C20ζ-EGFP
Моющего средства без лизата MDCK клеток, экспрессирующих всей длине PKCζ C-неизлечимо связаны с зеленого флуоресцентного белка (FLζ-EGFP) или церамида связывающий домен в С-конце PKCζ (C20ζ-EGFP) инкубировали с фосфатидилсерина / церамида пузырьки, как описанные в экспериментальной процедуры. После элюирования колонки MACS, белков анализировали с помощью иммуноблоттинга и антител против PKCζ и EGFP для обнаружения элюировали белок 2.
Рисунок 1. LIMACS из EGFP меченных PKCζ и его С-концевой фрагмент C20ζ использованием фосфатидилсерина / церамида пузырьков.
Моющие средства без лизатах MDCK клеток, экспрессирующих EGFP (как необязательные контроля), полная длина PKCζ-EGFP, или керамиды обязательными, С-концевой фрагмент C20ζ-EGFP инкубировали с фосфатидилсерина / церамида пузырьки, как описано в разделе экспериментальных процедур . После использования LIMACS, белок элюировали буфером образец SDS и анализируют SDS-PAGE и иммуноблоттинга. Левая панель показывает, что EGFP не связываться с пузырьками сохраняется с Аннексин V-связанных магнитных бус. Средняя и правая панель показывает, что полная длина PKCζ-EGFP и C20ζ-EGFP были сохранены из-за привязки к керамиды.
Для проверки конкретного взаимодействия между липидной и его связывания с белками препятствуют вложению липидов в клеточной мембране. Клеточная мембрана состоит из смеси нескольких липидов и белков, и организованная в липидных микродоменов или плотах. Таким образом, совместное очистки микродоменов и белки, не может четко отличить, если белок непосредственно связывается с липидной или только обогащенный микродоменной структуры. Другие методы, использующие определенный липидов покрытием на поверхностях, таких как липидные ИФА или Plasmon резонансной спектроскопии можно обнаружить взаимодействие конкретных липидного с его связывания с белками .. Однако, чтобы определить это взаимодействие в физиологически соответствующих мембраны окружающей среды, поверхность (например, для Plasmon резонансной спектроскопии) должна быть покрыта липидные пузырьки или липосомы.
Мы разработали новый пузырь липидного анализа связывания в качестве альтернативы этим предыдущих методов. Новизна приходит от включения якоря липидов (фосфатидилсерина) в пузырьки, что позволяет изоляцию липидных везикул с Аннексин V-сопряженных магнитных бус. Поэтому мы назвали этого анализа липидных везикул-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных активированный сортировки ячейки (LIMACS). LIMACS может быть выполнена для эндогенных белков, белки экспрессируются в клетках, или рекомбинантных белков воссоздана в белковый комплекс липидного 1-3.
Белок связан с липидные пузырьки могут быть восстановлены, просто беря MACS столбец из магнитных стоять и элюирования его с соответствующим буфером. Это может быть ферментом совместимы буфера для измерения активности фермента в элюата или SDS образец буфера для выполнения анализа с использованием белков SDS-PAGE и иммуноблоттинга. При использовании SDS образец буфера MACS столбец не должны быть удалены от магнитного стенд, который позволяет сохранение магнитных шариков на стенде.
Существуют меры предосторожности при использовании LIMACS. Очевидно, что LIMACS не может быть использована с моющим средством лизат, потому что это разрушит липидных везикул. Кроме того, она должна быть проверена, если связывающий белок целевой липидного также связывается с фосфатидилсерина, потому что это липидные используется как якорь для связывания пузырьки на Аннексин V-сопряженных магнитных бус. . В некоторых случаях, фосфатидилсерина может привести к нарушению связывания с белком-мишенью. Таким образом, отрицательные контроля и управления с различными количествами фосфатидилсерина должны быть включены в анализ. Thesecontrols может быть легко выполнен с помощью липидных везикул, содержащих только фосфатидилсерина или смесь фосфатидилсерина с необязательными липидов. В том числе отрицательный контроль также необходим для клеточных лизатов, которые содержат значительное количество эндогенной фосфатидилсерина. Во избежание загрязнения с эндогенными липидных мембран или пузырьки, то рекомендуется, чтобы очистить Клеточный лизат, включив ультрацентрифугирования шаг 100000 мкг в течение 1 ч. Очевидно, что липидные связывающих белков в супернатант может быть только цитозольного, который является ограничение процедуры LIMACS. Существует возможность расширения LIMACS других липидов якорь, таких как GM1 и холерного токсина B субъединицы сопряженных с магнитной бусины.
Мы в настоящее время изучает возможность использования липид-специфических антител для LIMACS, что сделает использование якоря липидов для подготовки пузырьки ненужным. Один из полезных аспектов LIMACS является изоляция сложный липидный белок, который позволяет применять самые разнообразные белка аналитических методов, которые не являются реализуемыми .. Например, мы использовали LIMACS выделить восстановленные белковый комплекс полярность Par6/Cdc42 связанные с церамида связанного aPKC. Таким образом, LIMACS является мощным методом роман для анализа и изоляции липид-ассоциированных комплексов белка.
Эта работа была поддержана грантами NIH R01NS046835 и R01AG034389 и марте Dimes грант 6FY08-322. Отдельное спасибо посвящена г-жа Элеонора Браун (Miltenyi Biotec, Оберн, штат Калифорния), который очень помогло с ней понимание технологии MACS. Miltenyi щедро предоставили материал, используемый для демонстрации экспериментов на безвозмездной основе. Я также благодарен доктору Guanghu Ванг (Медицинский колледж Джорджии / Грузия медицинских наук университета, Augusta, GA), создавшим PKCζ выражения клеточных линий. Поддержка со стороны Института молекулярной медицины Медицинского колледжа Джорджии / Грузия медицинских наук университета (под руководство доктора Лин Мей) также признается.
Аннексин V-сопряженных магнитных бус и MACS микро-и minicolumns были предоставлены Miltenyi Biotec, Inc (Оберн, Калифорния). Все липиды высшей чистоты и получил от Avanti полярных липидов (Alabaster, AL).
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены