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そのターゲットの脂質とタンパク質の相互作用をテストするために我々は、MACSとターゲットの脂質とアネキシンV結合ホスファチジルセリンから合成されたアネキシンV -共役磁気ビーズと脂質小胞を使用。ターゲットの脂質に結合したタンパク質は、共同で精製し、ビーズから溶出した後に分析されます。
脂質はほとんどの精製操作にアクセスできない、したがって、細胞膜に埋め込まれているため、脂質タンパク質の相互作用の解析は困難です。別の方法として、脂質は脂質ELISAとプラズモン共鳴分光法のために使われる平らな表面上に塗布することができる。しかし、表面コーティングの脂質は、脂質結合特性のために重要であるかもしれない、ミクロドメイン構造を形成しない。さらに、これらのメソッドは、それらの標的脂質に結合する蛋白質の大量の精製のために許可されていません。
脂質のタンパク質相互作用をテストするのこれらの限界を克服し、脂質結合タンパク質を精製するために、我々は磁気活性化細胞選別(LIMACS)を使用して、脂質小胞を介したアフィニティークロマトグラフィーと呼ばれる新しい方法を開発した。この方法では、脂質小胞は、アネキシンV MACSのためのアンカーの脂質のようなターゲットの脂質、ホスファチジルセリンを用いて調製されています。ホスファチジルセリンはタンパク質アネキシンに高い親和性を示すVのホスファチジルセリン含有脂質の小胞は、磁性ビーズに結合するアネキシンVに結合した磁気ビーズを用いたユビキタス細胞膜のリン脂質である。脂質の小胞がライセート、細胞とインキュベートされている場合、ターゲット脂質への結合タンパク質はまた、ビーズに結合され、MACSを用いて共同で精製することができる。この方法は、組換えタンパク質の再構成する場合、対象脂質に結合するタンパク質複合体をテストするために使用することができます。
我々は、スフィンゴ脂質セラミドとし、共同浄化前立腺アポトーシス応答4(PAR - 4)、セラミド関連aPKCの結合タンパク質への非定型PKC(aPKC)との相互作用を表示するには、このメソッドを使用している。我々はまた、細胞極性関連タンパク質Par6およびCdc42との組換えaPKCのセラミド関連複合体の再構築のためにこのメソッドを使用している。脂質小胞がsphingo -またはリン脂質のさまざまな準備ができるので、LIMACSはその細胞膜の酷似脂質環境における脂質 - タンパク質相互作用のための多目的なテストを提供しています。追加の脂質蛋白質複合体は、脂質結合タンパク質、脂質小胞との共精製のプロテオミクス解析を用いて同定することができる。
1。はじめ
磁気活性化セルソーティング(LIMACS)技法を用いて脂質小胞を媒介としたアフィニティークロマトグラフィーは、セラミド結合蛋白質複合体1-3を分離するために我々の研究室で開発されました。もともと、脂質の小胞は小胞とその関連蛋白質を分離するために磁性粒子標識アネキシンVを(ホスファチジルセリンに非常にアフィン)を使用してMACSに許可されるセラミド、ホスファチジルセリン、から成っていた。セラミド関連極性複合体と細胞のセラミド結合タンパク質の分離の in vitro再構成に 3を溶解液のために我々はLIMACS技術を使用している。 LIMACSは、小胞の分離(例えば、糖脂質- specifcレクチンまたは脂質抗体)のために他の相互作用パートナーを使用して変更することができます。
2。実験手順
脂質小胞とaPKCBindingアッセイの準備
体外脂質-タンパク質極性複雑で
3。結果
LIMACSのPKCζ- EGFPの精製とセラミド結合ドメインC20ζ- EGFP
界面活性剤を含まないPKCζC -末端に緑色蛍光タンパク質(FLζ- EGFP)またはPKCζ(C20ζ- EGFP)のC末端におけるセラミド結合ドメインにリンクされている全長を発現しているMDCK細胞のライセートは、ホスファチジルセリン/セラミド胞などと一緒にインキュベートした実験手順で説明しています。 MACSカラムの溶出後、タンパク質は、イムノブロットおよび溶出したタンパク質2の検出のためのPKCζとEGFPに対する抗体を用いて解析した。
の図1。LIMACS EGFP標識PKCζとそのC -末端断片C20ζホスファチジルセリン/セラミド小胞を用いた。
実験手順の項で説明するようにEGFP(非結合制御など)、全長PKCζ- EGFP、またはセラミド結合、C -末端断片C20ζ- EGFPを発現するMDCK細胞の界面活性剤を含まない溶解物は、ホスファチジルセリン/セラミドの小胞とインキュベートした。 。 LIMACSを使用した後、タンパク質をSDSサンプルバッファーで溶出され、SDS - PAGEおよび免疫ブロッティングにより分析した。左側のパネルでは、EGFPは、アネキシンV -リンクされた磁気ビーズを保持小胞に結合していないことを示しています。真ん中と右のパネルはその完全な長さを示すPKCζ- EGFPとC20ζ- EGFPは、セラミドへの結合のために保持された。
脂質とその結合タンパク質間の特異的な相互作用をテストすることは細胞膜の脂質から埋め込むことによって妨げられている。細胞膜には、いくつかの脂質とタンパク質の混合物から成り、それは、脂質ミクロドメインまたは筏で構成されています。蛋白質が直接脂質に結合するかだけミクロドメイン構造に富んでいるそのため、マイクロドメインとタンパク質の共精製は、はっきりと区別できません。このような脂質のELISA法またはプラズモン共鳴分光法などの表面にコーティングされた定義された脂質を用いて他のメソッドは、その結合タンパク質との特異的脂質の相互作用を検出することができます..しかし、生理学的に関連する膜の環境、表面(例えば、プラズモン共鳴分光法のため)で、この相互作用を決定するためには、脂質小胞またはリポソームでコーティングする必要があります。
我々は、これら従来の方法に代わるものとして新たな脂質の小胞結合アッセイを開発した。目新しさは、アネキシンV -共役磁気ビーズによる脂質小胞の単離を可能にする小胞、中にアンカーの脂質(ホスファチジルセリン)を組み込んだから来ている。したがって、我々は、磁気活性化細胞選別(LIMACS)を使用して、このアッセイ脂質の小胞を介したアフィニティークロマトグラフィーと呼ば。 LIMACSが内在性タンパク質のために行うことができる、細胞、または組換えタンパク質で発現されるタンパク質は 、1〜3脂質のタンパク質複合体の再構成。
脂質小胞に結合した蛋白質は、単純に磁気スタンドからMACSカラムを取り、適当な緩衝液に溶出することにより回復することができます。これは、SDS - PAGEを用いて、イムノブロットタンパク質分析を行うために溶出液またはSDS試料緩衝液中で酵素活性を測定する酵素互換性のあるバッファのどちらかです。 SDSサンプルバッファーを使用する場合はMACSカラムには、スタンド上の磁気ビーズの保持を可能にする磁気スタンド、から削除する必要はありません。
LIMACSを使用する際の注意事項があります。これは脂質小胞を破壊するので、明らかに、LIMACSは、洗剤の溶解液で使用することはできません。また、それは、この脂質がアネキシンV -共役磁性ビーズに小胞の結合のためのアンカーとして使用されるため、ターゲットの脂質の結合タンパク質はまた、ホスファチジルセリンに結合する場合、テストする必要があります。 。いくつかのケースでは、ホスファチジルセリンは、標的タンパク質への結合が損なわれる可能性があります。したがって、ホスファチジルセリンの様々な量と陰性コントロールとコントロールはアッセイに含まれなければならない。 Thesecontrolsだけで容易にホスファチジルセリンまたは非結合脂質とホスファチジルセリンの混合物を含有する脂質小胞を用いて行うことができます。を含むネガティブコントロールは、内在性ホスファチジルセリンを大量に含む細胞ライセートが必要です。内因性脂質膜や小胞の混入を避けるために、それは1時間、100,000 × gで超遠心分離のステップを含めることにより、細胞ライセートをクリアすることを推奨します。それは上清中の脂質結合タンパク質だけLIMACS手続きの制限である細胞質ゾル、できることは明らかである。このような磁気ビーズと結合したGM1とコレラ毒素のBサブユニットのような他のアンカーの脂質にLIMACSを拡張する可能性があります。
我々は現在、小胞の調製のためのアンカーの脂質の使用が不要になるだろうLIMACSのための脂質特異的抗体の使用を、模索している。 LIMACSの有益な側面の一つは、実装可能ではないタンパク質の分析法の様々なことができる脂質のタンパク質複合体の分離です..例えば、我々は、セラミドに結合aPKCに関連付けられているPar6/Cdc42の再構成極性のタンパク質複合体を分離するためにLIMACSを使用している。したがって、LIMACSは脂質結合蛋白質複合体の解析と分離のための強力な新規な方法です。
この作品は、NIHの助成金R01NS046835とR01AG034389、そしてダイム助成6FY08 - 322の月によってサポートされていました。特別あなたがMACS技術に彼女の洞察力で大いに役立った夫人エレノアブラウン(Miltenyi Biotec社、オーバーン、カリフォルニア州)に捧げられる感謝。ミルテニーは、気前よく無料での実験のデモンストレーションのために使用される材料を提供しています。私はまた、細胞株の発現PKCζを生成博士広滬王(グルジア/グルジア健康科学大学の医科大学、オーガスタ、ジョージア州)に感謝しています。グルジア/グルジア健康科学大学(リン博士は梅の指揮下)の医科大学分子医学研究所のサポートも認められている。
アネキシンV -共役磁気ビーズとMACSマイクロとminicolumnsはミルテニーバイオテク株式会社(オーバーン、カリフォルニア州)から提供された。すべての脂質は、最高純度のものであったとAvanti極性脂質(アラバスター、AL)から入手。
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