Сбор переменной концентрации Изотермические наборов калориметрия титрования с целью определения обязательных механизмов

ЦМТ представляет собой мощный инструмент для изучения связывания лиганда с его хозяином. В сложных системах однако, несколько моделей, может соответствовать данным одинаково хорошо. Метод, описанный здесь, предоставляет средства для выяснения соответствующей моделью привязки для сложных систем и извлечь соответствующие термодинамических параметров.

Изотермические калориметрии титрования (ЦМТ) обычно используется для определения термодинамических параметров, связанных с связывание лигандов с хостом макромолекулы. МТЦ имеет некоторые преимущества по сравнению с общим спектроскопических подходы для изучения хост / лиганд. Например, тепла, выделяемого или поглощаемого когда два компонента взаимодействуют непосредственно измеряется и не требует каких-либо экзогенных журналистам. Таким образом, обязательными энтальпии и постоянной ассоциации (Ka) непосредственно получить из данных ЦМТ, и может быть использована для расчета энтропийного вклада. Более того, форма изотермы зависит от с-стоимость и механистической модели участвуют. С-стоимость определяется как C = N [P] ТКА, где [Р] т является концентрация белка, а п-число лиганд связывающих участков в пределах хоста. Во многих случаях, множественные сайты связывания данного лиганда неэквивалентный и МТК позволяет характеристика термодинамических параметров связывания для каждого отдельного сайта связывания. Это, однако, требует, чтобы правильная модель привязки быть использованы. Этот выбор может быть проблематичным, если различные модели может поместиться в тех же экспериментальных данных. Ранее нами было показано, что эта проблема может быть преодолена путем проведения экспериментов на нескольких с-значениями. Несколько изотерм, полученных при различных с-значения подходят одновременно для отдельных моделей. Правильная модель следующего определены на основе критерия согласия во всем переменным с набором данных. Этот процесс применяется здесь, чтобы аминогликозидов сопротивление вызывающих фермента аминогликозидов N-6'-ацетилтрансферазы-II (AAC (6 ')-II). Хотя наша методология применима к любой системе, необходимость этой стратегии лучше продемонстрировал макромолекулы-лиганд система показывает allostery или кооперативности, и когда различные обязательные модели обеспечивают практически идентичны подходит для тех же данных. Насколько нам известно, Есть нет таких систем на коммерческой основе. AAC (6 ')-II, является гомо-димер, содержащий два активных центров, показывая кооперативности между двумя подразделениями. Однако ЦМТ данных, полученных на одном с-значение может быть одинаково хорошо подходит, по крайней мере две различные модели двух наборов-оф-сайты независимых модели и два сайта последовательными (кооперативные) модели. Через различные с-значение, как указывалось выше, было установлено, что правильная модель привязки для AAC (6 ')-Ii состоит из двух последовательных сайте модель привязки. Здесь мы опишем шаги, которые необходимо предпринять при выполнении ITC экспериментов с целью получения данных подходит для переменной с анализами.

1. Подготовка исходных растворов

1. Purify макромолекулы интересов. (В этом случае, аминогликозидов N-6'-ацетилтрансферазы-II (AAC6'-II), выделяется в виде сообщается в другом месте. ¹³⁾
2. Подготовка 4 литра диализа буфера. (В данном случае мы использовали 25 мМ 4 - (2-гидроксиэтил)-1-piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES, МВт 238,3 г / моль), содержащий 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, МВт 292,2), при рН 7,5).
3. Диализировать белка AAC (6 ')-Ii образца (5 мл на 400 мкМ) должны быть диализу в буфере диализа (3 х 1,3 л). Окончательное решение диализа сохраняется для полоскания машина и для разбавления образцов.
4. Фильтры окончательное решение диализа через фильтр 0,45 мкм целлюлозы и хранили при 4 ° C. Будет называться "работает буфер '
5. Фильтры белкового раствора через шприц 0,2 мкм фильтр, который был тщательно промыть под управлением буфера. Меру окончательной концентрации белка с использованием стандартного анализа (Bradford, Lowry и т.д.) или УФ-поглощению. Магазин белка максимально долгосрочной стабильности. (В случае AAC (6 ')-II, это означает, хранения при 4 ° C. AAC (6')-Ii не сохраняет активность после замораживания и оттаивания).
6. Подготовка 200 мкл 25 мМ маточного раствора ацетил-кофермент (AcCoA, лиганд, МВт 809,57) путем растворения 4,0 мг в управлении буфером. Замораживание при -78 ° С до готовности к использованию.
7. Все белка и лиганда образцы должны быть получены от тех же растворы, чтобы свести к минимуму случайные выборки к выборке колебания концентрации. Единый поправочный коэффициент для концентрации белка по всей переменной в наборе данных настраивается в анализе ^10.

2. Подготовка образцов МТЦ

1. Разбавьте раствор фермента в с-значение 64 с окончательным объемом 2 мл. (В случае AAC (6 ')-II, что соответствует 192 мкм.)
2. Быстрое таяние лиганд (AcCoA) исходный раствор в ледяной воде.
3. Подготовка 0,5 мл раствора AcCoA 10 раз более концентрированный то число сайтов связывания на белке, в данном случае 4 мм, путем разбавления 80 мкл исходного раствора AcCoA в 420 мкл буфера работает. Перевод на пипетку заполнения трубы. Быстрое возвращение решение AcCoA акции до -78 ° C.
4. Дега белка и решений под вакуумом в течение 5 мин при температуре 1 ° С ниже желаемой рабочей температуры (19 ° С).

3. Настройка шприц ¹⁴

1. Вставьте инъекции шприцем через шприц держатель пока предварительно смонтированный шприц зажим на той же высоте, как держатель.
2. Поток второй зажим шприца через инъекции шприцом, чтобы она плотно прижимается к нижней части шприца держателя. Аккуратно затянуть хомут при условии, 0,050 "Болл Драйв Hex Point.
3. Место шприца держателя в держатель пипетки.
4. Аккуратно вставьте пипетку инжектора в инъекции шприцем. Убедитесь, что наконечник плунжера подается непосредственно в отверстие шприц. После полной вставлены, винт блокировки воротник шприц держатель в пипетку инжектора.

4. Загрузка образцов ячейки ¹⁴

1. Вымойте кювету с минимум 50 мл работает буфер и удалить оставшуюся жидкость с помощью долгосрочных иглами 2,5 мл стеклянный шприц.
2. Медленно привлечь минимум 1,8 мл анализируемого раствора белка в чистом и сухом долгосрочной иглами 2,5 мл шприца. Будьте осторожны, чтобы не вводить никаких пузырей.
3. Осторожно вставьте иглу в кюветы и нежно прикоснуться к нижней части клетки. Поднимите кончик слегка (~ 1 мм) и осторожно вводят AAC (6 ')-Ii раствора в камеру, пока лишняя жидкость видна выше верхней части кюветы.
4. Медленно поднимите иглу около 1 см, обеспечивая при этом остается в жидком переполнения. Быстро снять, и вводят небольшое количество раствора (~ 0,25 мл), чтобы удалить какой-либо захваченных пузырьков в пробе клеток.
5. Удалите все решения переполнения. Это достигается за счет мягко скользящей иглой наряду переполнения в образец клеток. Наконечника шприца ударит выступ, это желание высоты для работы решение. Удалите всю жидкость, которая находится на этой линии.

5. Загрузка инъекции шприцем и инициирование запуска ¹⁴

1. Прикрепите пластиковый шприц загрузки заполнить трубу в порт.
2. Нижний наконечник плунжера в начало заполнять порт.
3. Место решение AcCoA в пипетку заполнения трубки в нижней части держателя пипетки. Наконечника шприца не должны касаться нижней части заполнения трубы.
4. Медленно привлечь раствора в шприце пока небольшое количество поступает в трубку загрузки шприца.
5. Закрыть заполнить порта за счет снижения наконечник плунжера и нажмите на кнопку Закрыть Заполните порта. Чистки и пополнения счета, нажав на Purge-> кнопка Refill, 3 раза, чтобы удалить пузырьки воздуха, которые могут попасть в ловушку во время загрузки.
6. Удалить заполнения трубки из пипетки держатель и осторожно протрите наконечника шприца.
7. Возьмите пипетку сборки и аккуратно опустите шприца в кюветы. Выполните медленно, как шприц можно легко согнуть, поэтому особое внимание на то необходимости. Обеспечить шприц полностью вставлен, нажав на базе блокировки воротник.
8. Установите нужное рабочей температуры (в данном случае 20 ° C) и выберите ссылку власти, который немного больше, чем максимальный тепловой поток инъекции ожидается (в данном случае 20μcal/sec).
9. Программа желаемого инъекций объемов и задержек. (В этом случае, 28 инъекций были заняты. Первая инъекция была объемом 2 мкл с 60 с задержкой. Все последующие инъекции были объемах 10 мкл с задержкой 330 сек.)

6. Последующих запусках

1. Во всех последующих запусков повторите шаги 2-5, при уменьшении AAC (6 ')-II И AcCoA концентрации на коэффициент 2,4,8,16 и 32.

7. Анализ данных

1. Использование установки процедура, которая глобально подходит все изотермы на единый набор обязательных параметров, как описано выше ^10.

8. Представитель Результаты

Представитель данные представлены на рисунке 1. Форма изотермы должны меняться в зависимости от концентрации. Более резкие переходы ожидаются выше с-значения (то есть больше белка и лиганда концентрации) (рис. 2).

В случае AAC (6 ')-II, два сайта последовательными модель дает лучше подходит, чем один описывающих два набора одинаковых, независимых сайтов с регулируемым стехиометрии.

Рисунок 1. Изотермы производства титрования AcCoA (3,86 ммоль) в AAC (6 ')-Ii (192 мкМ). А) Сырье следа ЦМТ. B) Интегрированный значения, используемые для определения обязательных параметров (квадраты) с 2-сайта последовательными подходит (-).

Рисунок 2. ITC изотермы AcCoA титруют в AAC (6 ')-Ii при различных концентрациях. Экспериментальными данными (кружки) были пригодны для 2-наборов-оф-сайты независимых модели (пунктирная пурпурный) и 2-сайте последовательной модели (сплошная синяя). 2-сайте sequentional модель, очевидно, дает лучшую общую соглашения. Концентрации были заняты) 6 мкм, 0,25 мм, B) 12 мкм, 0,25 мМ, С) 24 мкМ, 0,5 мм, D) 48 мкМ, 1,0 мм, E) 96 мкМ, 1,9 мм и F) 196 мкМ, 3,86 мм, для AAC (6 ')-II И AcCoA соответственно.

Эта аналитическая часть переменной с установки был ранее подробно описаны ^10. Здесь мы приводим практические аспекты сбора переменных данных с подходящим для этого подхода. Очень важно, чтобы все белка и лиганда образцы взяты из тех же растворов акций. Поэтому важно, чтобы достаточное маточного раствора готовится первоначально завершить целую серию экспериментов. Это гарантирует, отношение AAC (6 ')-II И AcCoA постоянно среди всех экспериментов, а также снижает случайные флуктуации концентрации на выборки к выборочной основе.

В этом случае, многое необходимо соблюдать осторожность при обращении с лигандом. AcCoA химически неустойчивы в растворах, поэтому важно, что исходный раствор остается в жидком состоянии в течение очень коротких промежутков времени. Как только необходимые суммы аликвоты от маточного раствора, акции должны быть немедленно замораживать. Если этого не сделать, то AcCoA может со временем ухудшаться и концентрации не будет правильным в дальнейшем работает. Как только аликвоты, AcCoA образцы должны быть использованы немедленно. В случае с белками, которые являются нестабильными, подобные меры будут необходимы.

Эта процедура может быть легко модифицирована для изучения других сложных систем. ¹⁰ используемых концентрациях должны быть адаптированы к константы связывания конкретной системы. Широкий диапазон значений с примерно между 1 и 1000 ^8,10 требуется по набору данных.

Работа выполнена при поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR), Национальным научным и инженерным исследованиям Совета (NSERC), а также обучение CIHR предоставлять стипендии (для LF). Мы благодарим профессора Джерарда Д. Райт (McMaster University, Канада) для AAC (6)-Ii выражение плазмиды.