Raccolta variabile concentrazione dataset Calorimetria isotermica di titolazione per determinare meccanismi vincolanti

ITC è un potente strumento per studiare il legame di un ligando al suo ospite. Nei sistemi complessi tuttavia, alcuni modelli può montare il dati ugualmente bene. Il metodo qui descritto fornisce un mezzo per chiarire il modello appropriato vincolante per i sistemi complessi ed estrarre i parametri termodinamici corrispondenti.

Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è comunemente usato per determinare i parametri termodinamici associati al legame di un ligando ad una macromolecola host. ITC ha alcuni vantaggi rispetto ai comuni approcci spettroscopiche per lo studio di host / ligando interazioni. Per esempio, il calore prodotto o assorbito quando le due componenti interagiscono viene misurata direttamente e non richiede alcuna giornalisti esogeni. Così l'entalpia vincolante e la costante di associazione (Ka) sono direttamente ottenute dai dati ITC, e può essere utilizzato per calcolare il contributo entropico. Inoltre, la forma della isoterma dipende dal c-valore e il modello meccanicistico coinvolti. Il c-valore è definito come c = n [P] PTG, dove [P] t è la concentrazione di proteine, e n è il numero di siti di legame all'interno dell'ospite. In molti casi, diversi siti di legame per un ligando dato non sono equivalenti e ITC permette la caratterizzazione dei parametri termodinamici vincolanti per ogni singolo sito vincolanti. Ciò richiede tuttavia che il modello corretto vincolante essere utilizzato. Questa scelta può essere problematico se diversi modelli può andare bene gli stessi dati sperimentali. Abbiamo già dimostrato che questo problema può essere aggirato effettuando esperimenti in diverse c-valori. Le isoterme più disponibili presso diversi c-i valori sono idonei contemporaneamente modelli separati. Il modello corretto è vicino identificato sulla base della bontà di adattamento su tutta la variabile-c dataset. Questo processo viene applicato qui per la aminoglicosidi resistenza che causano aminoglicosidi enzima N-6'-acetiltransferasi-Ii (AAC (6 ')-II). Anche se la nostra metodologia è applicabile a qualsiasi sistema, la necessità di questa strategia è meglio dimostrato con una macromolecola-ligando sistema che mostra allostery o cooperatività e, quando diversi modelli vincolanti fornire adatta sostanzialmente identica agli stessi dati. A nostra conoscenza, non esistono sistemi di questo tipo disponibile in commercio. AAC (6 ')-II, è un homo-dimero contenente due siti attivi, che mostra cooperatività tra le due subunità. Tuttavia i dati ITC ottenuti ad un singolo c-valore può essere adatta altrettanto bene ad almeno due diversi modelli un modello a due-set-di-siti indipendenti e due siti sequenziale (cooperativa) modello. Attraverso variando il valore C come spiegato sopra, è stato stabilito che il modello corretto vincolante per AAC (6 ')-II è un due siti modello sequenziale vincolanti. Qui, descriviamo i passi che devono essere presi durante l'esecuzione di esperimenti ITC al fine di ottenere set di dati idonei per la variabile-c analisi.

1. Preparazione di soluzioni di riserva

1. Purificare la macromolecola di interesse. (In questo caso, aminoglicosidi N-6'-acetiltransferasi-Ii (AAC6'-II), è isolato come riportato altrove. ¹³⁾
2. Preparare 4 litri di buffer di dialisi. (In questo caso abbiamo utilizzato 25 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, MW 238,3 g / mol), contenente 2 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 292,2 MW), a pH 7.5.)
3. Dializzare la proteina La (6 ')-Ii AAC campione (5 ml a 400 mM) utilizzati devono essere dializzati nel buffer di dialisi (3 x 1,3 L). La soluzione di dialisi finale è tenuto a lavare la macchina e per diluire campioni.
4. Filtrare la soluzione finale dialitica attraverso un filtro da 0,45 micron di cellulosa, e conservato a 4 ° C. Sarà denominato 'tampone di corsa'
5. Proteine ​​filtro soluzione attraverso un filtro 0,2 micron siringa che è stato sciacquato accuratamente con tampone di corsa. Misurare la concentrazione finale della proteina usando un test standard (Bradford, Lowry, ecc) o assorbimento UV. Conservare la proteina per ottimizzare stabilità a lungo termine. (Nel caso di AAC (6 ')-Ii, questo significa conservazione a 4 ° C. AAC (6')-Ii non mantiene l'attività dopo il congelamento e scongelamento).
6. Preparare 200μL soluzione madre di 25 mM di acetil coenzima A (ACCOA, il ligando, 809,57 MW), sciogliendo 4,0 mg nella gestione del buffer. Congelare a -78 ° C fino al momento dell'uso.
7. Tutte le proteine ​​e campioni ligando deve provenire dalla soluzione madre stessa, per ridurre al minimo casuale campione a campione le fluttuazioni nella concentrazione. Un fattore di correzione unico per la concentrazione di proteine ​​su tutta la variabile-c set di dati viene regolata nell'analisi ^10.

2. Preparazione campioni ITC

1. Diluire la soluzione enzimatica di un c-valore di 64 con un volume finale di 2 ml. (Nel caso di AAC (6 ')-Ii, ciò corrisponde a 192 micron.)
2. Rapidamente il disgelo (ACCOA) soluzione di legante magazzino in acqua ghiacciata.
3. Preparare 0,5 mL di una soluzione ACCOA 10 volte più concentrato quindi il numero di siti di legame della proteina, in questo caso 4 mm, diluendo 80 ml di soluzione madre ACCOA in 420 ml di buffer di esecuzione. Trasferire in un tubo pipetta di riempimento. Tornare rapidamente alla soluzione madre ACCOA a -78 ° C.
4. Degas le proteine ​​e le soluzioni sotto vuoto per 5 minuti ad una temperatura 1 ° C al di sotto della temperatura desiderata in esecuzione (19 ° C).

3. Impostazione della siringa ¹⁴

1. Inserire la siringa attraverso titolare siringa fino a quando il morsetto siringa pre-montato è alla stessa altezza del titolare.
2. Alimentare il secondo morsetto siringa sopra la siringa d'iniezione fino a quando è saldamente premuto contro la parte inferiore del titolare siringa. Stringere la fascetta con l'apposita 0,050 "Drive Hex Point Ball.
3. Luogo titolare siringa nel supporto pipetta.
4. Far scorrere delicatamente l'iniettore pipetta nella siringa d'iniezione. Assicurarsi che la punta pistone è alimentato direttamente nel buco della siringa. Una volta completamente inserito, avvitare il collare di bloccaggio del titolare siringa nel iniettore pipetta.

4. Caricamento della cella campione ¹⁴

1. Lavare le cellule campione con un minimo di 50 ml di tampone in esecuzione e rimuovere eventuali residui di liquido utilizzando un lungo ago, siringa 2,5 ml di vetro.
2. Lentamente disegnare un minimo di 1,8 ml di soluzione campione di proteine ​​nel pulito ed asciutto lungo agugliato siringa 2,5 ml. Fare attenzione a non introdurre eventuali bolle.
3. Inserire con cautela l'ago nella cella del campione e delicatamente toccare il fondo della cella. Alzare punta leggermente (~ 1 mm), iniettare delicatamente AAC (6 ')-Ii soluzione nella cella fino a quando il liquido in eccesso è visibile sopra la parte superiore della cella campione.
4. Sollevare lentamente l'ago di circa 1 cm, garantendo nel contempo rimane liquido nel overflow. Ritirare rapidamente e iniettare una piccola quantità di soluzione (~ 0,25 ml) per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nella cella campione.
5. Rimuovere tutti i trabocco soluzione. Ciò si ottiene facendo scorrere delicatamente l'ago lungo il lato di overflow nella cella del campione. La punta della siringa ha colpito una sporgenza, questa è l'altezza desiderio per la soluzione in esecuzione. Rimuovere tutto il liquido che si trova sopra di questa linea.

5. Caricamento siringa e l'avvio di eseguire ¹⁴

1. Attaccare la siringa di plastica tubo di carico in porta di riempimento.
2. Stantuffo punta inferiore alla parte superiore della porta di riempimento.
3. Posto la soluzione ACCOA nel tubo pipetta riempimento nella parte inferiore del titolare pipetta. La punta della siringa non deve toccare il fondo del tubo di riempimento.
4. Lentamente disegnare la soluzione nella siringa fino a quando una piccola quantità entra nel tubo della siringa di carico.
5. Chiudere la porta di riempire abbassando la punta del pistone e cliccare sul pulsante Chiudi Porto Fill. Spurgo e riempimento, cliccando sul Purga-> pulsante Refill, 3 volte per rimuovere eventuali bolle d'aria che possono essere stati intrappolati durante il caricamento.
6. Rimuovere il tubo di riempimento da parte del titolare pipetta e pulire delicatamente la punta della siringa.
7. Prendete il montaggio pipetta e siringa abbassare delicatamente nella cella del campione. Procedete lentamente la siringa può facilmente piegare, così grande cura è necessaria. Assicurarsi che la siringa sia completamente inserito premendo sulla base del collare di bloccaggio.
8. Impostare la temperatura desiderata in esecuzione (in questo caso 20 ° C), e selezionare una potenza di riferimento che è leggermente superiore alla portata massima di iniezione di calore prevista (in questo caso 20μcal/sec).
9. Programmare il volume di iniezione desiderato e ritardi. (In questo caso, 28 iniezioni sono state impiegate. La prima iniezione aveva un volume di 2 microlitri con un ritardo di 60 s. Tutte le iniezioni successive avevano volumi di 10 L con ritardi di 330 s).

6. Esecuzioni successive

1. In tutte le esecuzioni successive ripetere i passaggi 2-5, mentre diminuisce AAC (6 ')-Ii e concentrazioni ACCOA di un fattore di 2,4,8,16 e 32.

7. Analisi dei dati

1. Utilizzare una procedura di montaggio che si inserisce a livello globale di tutte le isoterme ad un unico insieme di parametri di associazione, come descritto in precedenza ^10.

8. Rappresentante Risultati

Dati rappresentativi sono mostrati in Figura 1. Le forme delle isoterme deve variare con la concentrazione. Più nitide le transizioni sono attesi per una maggiore c-valori (ad esempio proteine ​​superiore e le concentrazioni di ligando) (Figura 2).

Nel caso di AAC (6 ')-Ii, i due-sito modelli sequenziale dà una misura migliore di quella che descrive due gruppi di uguali, siti indipendenti con stechiometrie regolabile.

Isoterme Figura 1. Prodotta dalla titolazione di ACCOA (3,86 mM) in AAC (6 ')-Ii (192 mM). A) traccia ITC Raw. B) I valori integrato utilizzato per determinare parametri di associazione (quadrati) con una vestibilità 2-site sequenziale (-).

Figura 2. Isoterme ITC per ACCOA titolato in AAC (6 ')-Ii a concentrazioni variabili. I dati sperimentali (cerchi aperti) erano idonei ad un modello 2-set-di-siti indipendenti (magenta tratteggiata) e un 2-sito modelli sequenziale (solido blu). Il 2-sito modelli sequentional dà chiaramente un accordo generale migliore. Le concentrazioni sono state impiegate A) 6 micron, 0,25 mm, B) 12 mM, 0,25 mM, C) 24 mM, 0,5 mM, D) 48 mM, 1,0 mM, E) 96 mM, 1,9 mm, ed F) 196 micron, 3,86 mm, per AAC (6 ')-Ii e ACCOA rispettivamente.

Questa porzione analitica di variabile-c raccordo è stato precedentemente descritto in dettaglio ^10. Qui riportiamo gli aspetti pratici della raccolta di set di dati idonei per questo approccio variabile-c. E 'essenziale che tutte le proteine ​​e campioni ligando sono tratti dalle soluzioni stesso ceppo. Perciò è importante che la soluzione scorte sufficienti è preparato inizialmente per completare l'intera serie di esperimenti. In questo modo il rapporto tra AAC (6 ')-Ii e ACCOA è costante tra tutti gli esperimenti, e riduce le fluttuazioni casuali nella concentrazione su un campione a campione base.

In questo caso, molta cura deve essere presa nella gestione del ligando. ACCOA è chimicamente instabile in soluzione ed è quindi essenziale che la soluzione madre rimane liquido per periodi di tempo molto breve. Una volta che l'importo in questione è aliquotati dalla soluzione di riserva, il titolo deve immediatamente essere ricongelati. Se ciò non avviene, allora il ACCOA possono degradare nel tempo e la concentrazione non sarà corretta in successive esecuzioni. Una volta aliquotate, campioni ACCOA deve essere utilizzato immediatamente. Nel caso di proteine ​​che sono instabili, le precauzioni simili sarà necessario.

Questa procedura può essere facilmente modificato per studiare altri sistemi complessi. ¹⁰ Le concentrazioni utilizzati devono essere adattati alle costanti vincolante del sistema specifico. Una vasta gamma di valori di c tra circa 1 e 1000 ^8,10 è richiesto in tutto il set di dati.

Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR), National Science and Engineering Research Council (NSERC), e una formazione CIHR borsa di studio (di LF). Ringraziamo il Prof. Gerard D. Wright (McMaster University, Canada) per la CAA (6)-Ii plasmide di espressione.