Индукция и мониторинг активных гиперчувствительность замедленного типа (DTH) у крыс

Замедленного типа гиперчувствительности (DTH) является воспалительная реакция опосредована CCR7-эффекторные лимфоциты памяти T. Здесь показано, как вызвать активный DTH у крыс Льюиса и контролировать воспалительную реакцию.

Замедленного типа гиперчувствительности (DTH) является воспалительная реакция опосредована CCR7-эффекторные Т-лимфоциты памяти, что проникнуть в месте введения антигена, против которого иммунная система была загрунтовать. Воспалительная реакция характеризуется покраснением и отеком сайт антигенный вызов. Это удобная модель для определения в естественных условиях эффективность иммунодепрессанты. Кожные DTH могут быть вызваны либо приемных передачи антиген-специфические Т-лимфоциты или активной иммунизации с антигеном, и последующие внутрикожные проблема с антигеном, чтобы вызвать воспалительную реакцию в данной области кожи. DTH реакции могут быть вызваны на различные антигены, например, яичный альбумин, туберкулин, столбняка, или замочную скважину блюдечко гемоцианин (KLH).

Здесь показано, как вызвать активную реакцию в DTH Льюис крыс. Мы сначала подготовить водно-нефтяной эмульсии из KLH, наш антиген представляющих интерес, в полном адъюванте Фрейнда и придать этой эмульсии подкожно крыс. Это будет премьер иммунной системы, чтобы развить память Т-клеток, направленных на KLH. Семь дней спустя мы будем вызов крыс внутрикожно на спине с KLH с одной стороны и с овальбумина, не имеет значения антиген, с другой стороны. Воспалительная реакция будет виден 16-72 часов спустя и красные и опухшие области будет оцениваться как указание DTH тяжести.

1. Подготовка эмульсии

1. Эмульсия смеси 1:1 антигена (DTH могут быть вызваны на различные антигены: яичный альбумин, столбняка, замочную скважину блюдечко гемоцианин ....) в водном растворе добавляется полный адъювант Фрейнда. Это очень важно, чтобы добавить антигена адъювантной а не наоборот!
   
   
2. Существует большое количество отходов при принятии и потребителей инъекционных эмульсии, поэтому всегда готовятся 1,5 или 2 раза больше, чем то, что вам нужно.
   
   
3. Растворите антигена в физиологическом растворе для подготовки 2 мг / мл раствора. Не фильтровать, а вы не хотите потерять агрегатов!
   
   
4. Положите Фрейнда адъювантной H37Ra (Difco, каталог # 231131) в трубку и вихря на высокой скорости. Добавить антигена по капле в то время как вортексе. Когда все антиген добавил, вихревые еще 5 минут. Смесь должна стать белым.
   
   
5. Положите эмульсии в стеклянный шприц и связать его с другой стеклянный шприц использованием моста 18G (Fisher Каталог № 14-825-17L). Отправить эмульсии из шприца в другой, пока не становится трудно (5-10 мин). Лучше всего использовать два 5 мл шприцев. Если более 5 мл эмульсии необходимо, использовать несколько наборов 5 мл шприцев.
   
   
6. Эмульсии могут быть сохранены в шприцах при 4 ° С в течение 3 недель.

2. Иммунизация крыс

1. Смешайте эмульсии в шприцы в течение нескольких минут и трансфер в шприц для инъекций. Inject 200 мл подкожно в течение 1-2 сайтов в основании хвоста использованием 23G иглы и Луер-Лок наконечник 3 мл шприца.

3. Вызов с антигеном в спину

1. Семь дней после иммунизации, бриться два пятна на спине крысы и вводят внутрикожно 20 мл 1 мг / мл раствора антигена в одном месте и физиологического раствора (или не имеют отношения антиген) в другое место. Не фильтровать антигену решение, как вы можете потерять агрегатов, которые усиливают воспалительные реакции.
   
   
2. Крысы должны быть anesthesized, чтобы избежать движения. Inject решение внутрикожно использованием 27G ½ иглы и шприцы 1 мл. Изменение иглы между инъекциями.
   
   Примечание: эта задача может быть сделано в ушной раковины из ушей вместо того, чтобы вернуться к более точные измерения. Смотрите видео на https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/index/Details.stp?ID=325

4. Измерение DTH

1. Инъекции начнет становится красным и отек как признак воспаления. Измерьте диаметр воспаленной области с помощью линейки или, еще лучше, суппорта. Максимальное набухание должно произойти между 24 и 72 часов.

Для более точного измерения DTH реакцию мы рекомендуем сложных крыс с антигеном в ушной раковины из уха. Реакция может быть измерена как разница в ухе опухоль между соответствующим антигеном оспаривается уха и ухо оспаривается ни с солевым в одиночку или с антигеном не имеет значения. Демонстрация проблемой в ухо показано на рисунке 1.