RhoC GTPase Активация Пробирной

Этот протокол используется выпадающее анализ, чтобы определить уровень активной RhoC ГТФ внутри клеток.

RhoC GTPase имеет 91% гомологию с RhoA ГТФ. Из-за своей распространенности в клетках, многие реактивы и методики RhoA GTPase были разработаны. Тем не менее, RhoC GTPase выражается в метастатические раковые клетки при относительно низких уровнях. Таким образом, несколько RhoC-специфических реагентов были разработаны. Мы адаптировали анализа Rho активации для обнаружения RhoC ГТФ. Эта техника использует GST-связывающий белок Rho слияние домена вытащить активных GTPase RhoC. Кроме того, мы можем урожай общего белка в начале анализа для определения уровня общего (ГТФ и ВВП граница) RhoC ГТФ. Это позволяет для определения активной по сравнению с общим RhoC ГТФ в клетке. Несколько коммерческих версий этой процедуры были разработаны однако, коммерческие наборы, оптимизированные для RhoA ГТФ и, как правило, не работают хорошо для RhoC ГТФ. Части анализа были изменены, а также развитие RhoC-специфических антител.

1. Подготовка GST-синтез белка

1. Глицерин запасы JM109 компетентных бактерий содержащий первые N-терминал 90 аминокислот rhotekin Rho связывающий домен (РосБР) субклонировали BamH1/EcoR1 pGEX3x вектора сделаны.
   
   Чтобы убедиться в высокой эффективности следующие шаги должны быть выполнены для каждого эксперимента. По нашему опыту, свежеприготовленный GST-РосБР имеет ключевое значение для надежного и точного анализа активации ГТФ.
2. Добавить 50 мкл (приблизительно, не оттепель) глицерина акции до 50 мл LB усилителя и расти 37 ° С в течение ночи при встряхивании.
3. Развести 1:10 в 500 мл LB-усилителя и растут в течение 1 ч.
4. Вызвать GST-белка с 0,1 мМ IPTG течение 2 часов.
5. Распределите равномерно в центрифуге бутылок и центрифуга, Sorval GSA3 ротора при 5000 RPM 4 ° С в течение 20 мин.
6. Ресуспендируют крупинку в центрифуге бутылок, 10 мл лизирующего буфера *.
   * Бактериальный буфера Лизис: 20% сахарозы, 10% глицерин, 50 мМ Трис рН 8,0, 0,2 мМ Na ₂ S ₂ O _5, 2 мМ MgCl _2, 2 мМ DTT, добавить свежие PMSF, бензамида, апротинин и leupeptin.
7. Разрушать ультразвуком 2-3 мин (это зависит от типа sonicator. Мы используем Фишер Соник Dismembranator Модель 500 установил на отметке 6, 50% цикла).
8. Центрифуга Sorvall SS34, 20 мин 10.000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C. На данный момент небольшое аликвоту можно вынести и управляет SDS-PAGE. Гель может быть Кумасси окрашенных и группы должно быть очевидно, на уровне 46 кДа.
9. Удалить супернатант и добавьте 1 мл 50% glutatione-сефарозой 4B суспензии.
10. Инкубировать 30 мин при 4 ° С с вращением. Промыть 3 раза лизис буфера.
11. Ресуспендируют GST-RBD/glutatione-Sepharose бисера 50% раствора (примерно 1 мл) с GST-рыба буфера **. ** GST-Рыба буфера: 10% глицерин, 50 мМ Трис рН 7,4, 100 мМ NaCl, 1% NP-4, 2 мМ MgCl _2, добавить свежие PMSF, бензамида, апротинин и leupeptin

2. GST-фьюжн выпадающем анализа

1. Используйте 5-10 х 10 ⁶ клеток / Анализ
2. Вымойте клетки один раз в ледяной PBS, держите пластины на льду (мы используем плоские блюда стакан, наполненный льдом) и лизировать с 0,5 мл GST-рыба буфера.
3. Выдержите 5 минут на льду, урожай клеток с использованием полицейский резины или плоские забияка, трансфер в микроцентрифужную трубки и центрифуги 20000 оборотов в минуту 5 минут при 4 ° C.
4. Передача супернатант в новую пробирку и отцентрифугировать. Принимать по 50 мкл для определения общего Rho (т.е. ВВП + ГТФ оценка).
5. Добавить 0,5 мл GST-RBD/glutatione-Sepharose бисером и инкубировать при температуре 4 ° С, ночью с вращением.
6. Вымойте 6x с GST-рыба буфера.
7. Ресуспендируют бусины в 40 мкл 2х-Laemelli образец буфера
   На данный момент концентрация общего белка Rho аликвоту принятых в 2,4 должны быть определены и 30 мкг подготовленные для запуска в гель с соответствующего образца активации.
8. Отварите образцов при 90 ° С в течение 5 мин, центрифуги кратко и принять супернатант (т.е. избежать бусы) загрузить и запустить на 12-и 4-20% градиент SDS-PAGE гель.
9. Выполнить гель не выше 150 вольт, трансфер в использовании мембраны Towbin буфера и постоянного тока до 100 В.
10. Блок мембраны с 5% молока / TBST решения и зонд с RhoC-specfic антител.

3. Представитель Результаты

Хорошие результаты должны производить одну полосу примерно в 22 кДа. Плохие результаты производить несколько полос или высокий фон. Это свидетельствует о деградации белка, неполное промывки образцов или использование старых GST-РосБР.

Рисунок 1. Три отдельных клеточных линий, выражающих различные уровни RhoC GTPase показаны продемонстрировать низкий уровень активной и полной RhoC, высокий уровень активной и полной RhoC или нет RhoC. Пятно было тогда раздели и reprobed с антителами к ведению домашнего хозяйства гена актина в качестве управления загрузкой для общего белка RhoC.

Рисунок 2. Несколько полос или высоких результатов фон от деградации белка, неполное промывки образцов или использование старых GST-РосБР.

Наиболее критичным этапом процедуры является генерация свежих GST-РосБР. Невыполнение обратить пристальное внимание на этот шаг является основной причиной для отказа. Все шаги, от поколения GST-RBD (1.2) для инкубации в течение ночи с Клеточный лизат (2,5), должно быть сделано в течение одного дня. Еще один важный шаг, чтобы убедиться, что Есть достаточное количество клеток для получения клеточных лизатов. Это имеет особое значение при взгляде на RhoC ГТФ, который, как правило, присутствуют в низком уровне в клетке.

Кафедра обороны W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 и W81XWH-08-1-0356