Assay RhoC activation GTPase

Ce protocole utilise un menu déroulant d'essai pour déterminer les niveaux de GTPase RhoC actifs dans les cellules.

RhoC GTPase présente une homologie de 91% à RhoA GTPase. En raison de sa prévalence dans les cellules, de nombreux réactifs et des techniques de RhoA GTPase ont été développés. Toutefois, RhoC GTPase est exprimé dans les cellules cancéreuses métastatiques à des niveaux relativement bas. Par conséquent, quelques RhoC réactifs spécifiques ont été développés. Nous avons adapté un test d'activation de Rho GTPase pour détecter RhoC. Cette technique utilise un TPS-Rho protéine de liaison de fusion de domaine à sortir actifs GTPase RhoC. En outre, nous pouvons récolter des protéines totales au début de l'essai pour déterminer les niveaux du total (GTP et le PIB lié) GTPase RhoC. Ceci permet pour la détermination de la GTPase RhoC actifs par rapport au total dans la cellule. Plusieurs versions commerciales de cette procédure ont été développés cependant, les kits commerciaux sont optimisés pour RhoA GTPase et typiquement ne fonctionne pas bien pour RhoC GTPase. Pièces de l'essai ont été modifiés ainsi que le développement d'un anticorps spécifique RhoC.

1. Préparer la TPS protéine de fusion

1. Stocks de glycérol de bactéries compétentes JM109 contenant le premier N-terminale 90 acides aminés du domaine rhotekin Rho contraignant (RBD) sous-cloné dans le vecteur BamH1/EcoR1 pGEX3x sont faites.
   
   Garantir un rendement élevé les étapes suivantes doivent être effectuées pour chaque expérience. Dans notre expérience, fraîchement préparé TPS-RBD est la clé à un test d'activation GTPase robuste et précis.
2. Ajouter 50 uL (approximatif, ne pas décongeler) du stock de glycérol à 50 mL de LB ampères et de croître à 37 ° C pendant la nuit avec agitation.
3. Diluer à 1:10 dans 500 ml LB-amp et de grandir pendant 1 h.
4. Provoquer la TPS production de protéines avec 0,1 mM d'IPTG pendant 2 heures.
5. Répartir uniformément dans les bouteilles à centrifuger et centrifuger, Sorval GSA3 rotor à 5000 tours à 4 ° C pendant 20 min.
6. Resuspendre le culot dans des bouteilles de centrifugeuse, 10 ml de tampon de lyse *.
   * Tampon de lyse bactérienne: 20% de saccharose, glycérol 10%, 50 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM Na ₂ S ₂ O _5, 2 mM MgCl2, ₂ mM de DTT, Ajouter fraîche PMSF, benzamide, l'aprotinine et leupeptine.
7. Soniquer 2-3 min (cela dépend du type de sonicateur. Nous utilisons un modèle de Fischer Sonic Dismembranator 500 fixé à la marque 6, cycle de 50%).
8. Centrifugeuse, Sorvall SS34, 20 min 10 000 rpm à 4 ° C. A ce point une petite aliquote peut être souscrite et gérée par SDS-PAGE. Le gel peut être coloré au bleu de Coomassie et d'une bande doit être apparente à 46 kDa.
9. Enlever le surnageant et ajouter 1 mL de 50% glutatione-Sépharose 4B boue.
10. Incuber pendant 30 min à 4 ° C avec rotation. Laver 3 fois avec un tampon de lyse.
11. Remettre les billes GST-RBD/glutatione-Sepharose à une suspension de 50% (environ 1 mL) avec la TPS poissons tampon **. ** La TPS-Fish Tampon: 10% glycérol, 50 mM Tris pH 7,4, NaCl 100 mM, 1% NP-4, 2 mM MgCl _2, Ajouter fraîche PMSF, benzamide, l'aprotinine et leupeptine

2. Fusion GST pull down test

1. Utilisez 5-10 x 10 ⁶ cellules / test
2. Laver les cellules une fois en PBS glacé, gardez les plaques sur la glace (nous utilisons un plat en verre plat rempli de glace) et Lyse avec 0,5 mL TPS poissons tampon.
3. Incuber 5 min sur la glace, les cellules de récolte à l'aide d'un policier en caoutchouc ou scrapper plat, transfert à microcentrifugeuse tube et centrifuger 5 min 20000 rpm à 4 ° C.
4. Transférer le surnageant dans un tube de micro frais. Prenez 50 ul pour déterminer totale Rho (c'est à dire le PIB + GTP lié).
5. Ajouter 0,5 ml GST-RBD/glutatione-Sepharose perles et incuber à 4 ° C, nuit à la rotation.
6. Lavez 6x avec TPS-poissons tampon.
7. Remettre en suspension dans 40 perles tampon d'échantillon 2x-uL Laemelli
   À ce stade de la concentration de l'aliquote Rho protéines totales prise en 2.4 devrait être déterminée et 30 ug préparé pour être exécuté sur le gel avec l'échantillon d'activation correspondant.
8. Faire bouillir les échantillons à 90 ° C pendant 5 min, centrifuger brièvement et prendre surnageant (c'est à dire éviter les perles) charger et d'exécuter sur une pente de 12 puits 4-20% gel SDS-PAGE.
9. Exécuter un gel sans volts supérieure à 150, le transfert à la membrane en utilisant du tampon Towbin et constante de courant de 100 W.
10. Bloc membrane avec 5% de lait / TBST solution et sonde avec RhoC-specfic anticorps.

3. Les résultats représentatifs

De bons résultats devraient produire une bande unique à environ 22 kDa. Mauvais résultats de produire des bandes multiples ou bruit de fond élevé. Ceci est révélateur de la dégradation des protéines, le lavage incomplet des échantillons ou l'utilisation de l'ancienne TPS-RBD.

Figure 1. Trois lignées cellulaires séparées exprimant différents niveaux de RhoC GTPase sont présentés pour démontrer de faibles niveaux de RhoC actif et total, des niveaux élevés de RhoC active et totale ou ne RhoC. Le blot a ensuite été déshabillé et sondé avec un anticorps de la gène de l'actine maison gardant pour servir de contrôler le chargement de la protéine RhoC total.

Figure 2. Bandes multiples ou les résultats de fond élevé de dégradation des protéines, le lavage incomplet des échantillons ou l'utilisation de l'ancienne TPS-RBD.

L'étape la plus critique de la procédure est la nouvelle génération de TPS-RBD. Le défaut de porter une attention particulière à cette étape est la raison principale de l'échec. Toutes les étapes, de génération de la TPS-RBD (1.2) à l'incubation pendant la nuit avec le lysat cellulaire (2,5), devrait être fait en une seule journée. Une autre étape cruciale est de rendre certains qu'il ya suffisamment de cellules pour produire les lysats cellulaires. Ceci est d'une importance particulière quand on regarde RhoC GTPase, qui tend à être présents en faibles quantités dans la cellule.

Département de la Défense W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 et W81XWH-08-1-0356