Органотипической культуры взрослых сетчатки кролика

В этой статье показано вскрытие и инкубации сетчатки кролика и частица-опосредованного переноса генов плазмид кодирования GFP или различных субклеточных маркеров в ганглиозных клеток сетчатки.

Органотипической системы культуры функциональных нервных тканей являются важными инструментами в нейробиологических исследований. В идеале такая система должна быть совместима с методов визуализации, генетические манипуляции, и электрофизиологические записи. Здесь мы приведем простой межфазной культуры тканей система для взрослых сетчатки кролика, что не требует никакого специального оборудования и минимального обслуживания. Мы показываем, рассечение и инкубации сетчатки кролика и частица-опосредованного переноса генов плазмид кодирования GFP или различных субклеточных маркеров в ганглиозных клеток сетчатки. Кролик сетчатки культурный таким образом, может быть поддержана в течение 6 дней с очень небольшим изменением общей структуре анатомических или морфологии отдельных ганглиев и amacrine клеток.

Создание генной пушки пулями (GOLD)

1. Сделать 100X ПВП (0.5mg/ml) в 100% этанола.
2. Взвесьте из 30 мг BioRad 1,6 золота Micron микроносителей и поместить его в трубку 1,5 мл Eppendorf.
3. Рассчитать количество плазмиды, необходимых для получения концентрации 0,5-3 мкг плазмиды / мг золота, и место плазмиды в трубке с золотым микроносителях. Комбинат несколько плазмид, если необходимо.
4. Довести объем плазмиды до 100 мкл дистиллированной воды.
5. Добавить 100 мкл 0,05 М спермидина в трубку. Вихревые трубки 30 секунд.
6. Vortex 1 минуты на полной скорости. Разрушать ультразвуком в течение 3-5 минут ..
7. Сухой соответствующей длины Tefzel труб в аппарате Biorad PDS-1000/He течение 15 минут.
8. После обработки ультразвуком, вихревые в течение 1-2 минут на полной скорости. Снизить скорость медленно, чтобы трубка будет открыт в то время как вортексе.
9. Добавить 100 мкл 1 М CaCl ₂ медленно трубки капля в то время как мудрые вортексе.
10. Оставьте трубки при комнатной температуре в течение 10 минут.
11. Сделайте 5 микрон фильтр.
    1. Возьмите два 5 мл шприца без иглы.
    2. Удалите поршень, и отделить черные шапки. Принимая маленькие ножницы, отрезали часть черной кепке, чтобы дать кольцо. Повторите с другой поршень с чистым два кольца.
    3. Сэндвич 5 микрон (мелкие детали, Inc нейлоновый фильтр, ½ дюйма в диаметре) фильтр между двумя кольцами, и нажимаем бутерброд на кончике шприца.
    4. Мотаться через шприц 50 мл коническую колбу.
12. Через 10 минут, вихревые трубки в течение 30 секунд.
13. Центрифуга трубку в течение 30 секунд и сохранить гранул.
14. Добавить 1 мл 100% этанола для осаждения. Использование пипетки, чтобы разбить гранул, и вихрь 30 секунд. Спиновые 30 секунд и снять этанола. Повторить еще 2 раза.
15. Добавить 1 мл 100% этанола в гранулах (перерыв с наконечником). Место это в 5 микрон фильтр и дайте ему течь через под действием силы тяжести в 50 мл коническую трубку. Используйте больше этанола, сколько необходимо для промыть трубы или помочь с потоком до конца.
16. Спиновые 50мл трубки при 2000 оборотов в минуту в центрифуге в течение 5-10 минут. Удалить супернатант, за исключением гранул.
17. В зависимости от желаемой плотности микроносителях необходимо, добавьте 800μl-1,5 мл 100% этанола и соответствующих 8 мкл-15 мкл раствора ПВП.
18. Swirl и сразу же пойти в аппарате PDS-1000/He Biorad.
19. Biorad PDS-1000/He аппарата
    1. Отсоедините трубку, соединяющую бак N2 газа в трубке сушки
    2. Выньте сушки Tefzel трубы от машины
    3. Вставьте один конец в 50 мл коническую трубку, и присоединить шприц к другому концу трубы. Соси коричневого шлама в середине трубы.
    4. Вставьте трубку обратно в машину.
    5. Wait (без вращения) в течение 4 минут
    6. После 4-х минут, отсасывать этанола медленно и осторожно, стараясь не нарушить микроносителях.
    7. Поворот трубы на 1 минуту.
    8. Через 1 минуту подключения трубки, соединяющей N ₂ бензобак в сушильную трубку и пусть трубы высохнуть в течение 15 минут.
20. Через 15 минут, разрезать трубы, чтобы пуля размер будет использоваться сразу или хранить при температуре 4 ° С в эксикаторе. Пули могут храниться до 3 месяцев.

Подготовка генной пушки

1. Место пули в картридже. Каждая часть сетчатки могут быть сняты с 1-3 пуль.
2. Вставьте картридж в генной пушки и прикрепить пистолет к гелия источник. Установить давление до 110 пси.

Подготовка средств массовой информации

1. Препарирование среда
   
   

   1 бутылка Эймс решение (Sigma, 8.8g)

   1,9 г натрия гидрокарбоната

   10 мл 1% пера / стрептококк / L-глютамин (1:100) (Gibco / Invitrogen)

   990 мл дистиллированной водой до 1 л

   -------------------------------

   1 литр

   
   
   
2. Фильтры рассечение среды с использованием 0,22 мкм фильтр.
   
3. Инкубационный среде (500 мл)
   
   

   485 мл с фильтром СМИ рассечение

   5 мл 1% N2 дополнения (Gibco / Invitrogen)

   10 мл 1% лошадиной сыворотки (Sigma)

   500 мкл фенола красного

   -------------------------------------------------- -

   0,5 л

   
   
   
4. Фильтры среду инкубации использованием 0,22 мкм фильтр.
5. Bubble O ₂ в среде рассечение в течение 15 минут перед началом протокола сетчатки уборки урожая.

Подготовка инкубации камеры для сетчатки

1. Под капотом, заполнить несколько 60 мм в глубину блюда (инкубационный камер, Nunc) с 25 мл инкубационной среды. Количество блюд зависит от числа отставкеInAs необходимости.
2. Место фильтр стоять в каждую глубокую тарелку. Только самые кончики стоять не должен быть погружен в воду.
3. Поместите все глубокие блюда в инкубаторе до сетчатки готовы.
4. Заполните два 100 мм чашки Петри и довести до вскрытия скамейке.

Подготовка кролика сетчатки

1. Жертва кролика в соответствии с установленными протоколами. Следующие не должна быть выполнена под капотом.
2. С угловыми ножницами, вставьте его за глаза в глазнице из кролика, резка оболочки и зрительного нерва, которые прикреплены к глазу.
3. Аккуратно выньте глаз и промойте его кислородом СМИ рассечение.
4. Место глаза (роговица вверх) в колодец глаз резки и закрыть крышкой.
5. Место лезвием горизонтально прямо под крышкой. В одном движении, рисовать лезвием поперек глаз, чтобы отрезать роговицы, в результате чего глаз чашку.
6. Использование щипцов, удалить сетчатку глаза от среза хорошо и поместить его на фильтровальную бумагу.
7. Удаление стекловидного тела и линзы, зажимая области около разорвала зрительного нерва и потянув назад на фильтровальную бумагу. Повторите несколько раз, пока почти все стекловидное удаляется и наглазник выглядит спущена.
8. Место глаз чашки в чашку Петри с рассечением СМИ, чтобы помыться.
9. Вырезать глаза чашу в желаемое количество штук (5 штук максимум).
10. Возьмите одну часть глаза чашку и поместить его под микроскопом.
11. Зажим склеры и сосудистой оболочки легко собираются на краю сетчатки использованием щипцов. С другой стороны, использование тонкой кистью, чтобы кисть правой между сосудистой оболочки и сетчатки.
12. Использование коротких, нежных движений, дразнить сетчатки с сосудистой оболочкой, пока не отрывается.
13. Вырезать 1 дюйм от стерильной пипетки передачи. Используйте это, чтобы подлизываться сетчатки и положите в чашку Петри в среде инкубации мыть.
14. Используя другой стерильной пипетки передачи с 1 дюйм отрезать, тщательно передачи сетчатки на 0,4 мкм Millicell фильтром (Millipore, Cat No: PICMORG50).
15. Используйте кисточку, чтобы ориентировать сетчатке стороны ганглиозных клеток вверх.
16. Свести из сетчатки кистью слегка по краям сетчатки. Свернуть трогательные слой ганглиозных клеток с помощью кисти как можно больше.
17. Удалите излишки среды на фильтр с передачей пипетки.
18. Использование щипцов, передачи фильтра на изменение suctioner. Нарисуйте на suctioner 2-3 раза, чтобы удалить все среде инкубации с фильтром.

Торкрет Гена и инкубации сетчатки

1. Под капотом, место каждого из сетчатки содержащих-фильтров на фильтр стоит в 60 мм в глубину блюда (инкубационный камеры).
2. Убедитесь, что среда находится в контакте с нижней фильтр и что среда не перекинуться стороны фильтра на сетчатку. Фильтр должен выступать в качестве интерфейса между сетчаткой и среды.
3. Съемка каждой части сетчатки с двумя пулями. Место генной пушки прямо над ткани, около 3-4 см прочь.
4. Поместите все камеры инкубации на шейкере в 35 - 37 ° C инкубатора.
5. Замените среду инкубации с каждым днем. Сетчатки может быть инкубировали в течение не более 6 дней.

1. Что я могу сделать с помощью этого метода?

• Смотрите морфологии клеток ясно.
• Этикетка клетки для записи на них.
• Гиперэкспрессией белка, как и PSD95, но и других белков, которые модулируют ответ клетки, например, ионные каналы, рецепторы.
• Экспресс тормозных РНК.

2. Как долго я могу держать взрослого сетчатки?

• 4 дня это не проблема для взрослого кролика. После шести дней клетки выглядят "больной", то есть аксоны отказаться, ведь опухоль дендритов и регистрации света ответов становится ненадежным (только ~ 50% клеток оказались свет проблематику после этого времени.
• Мы продолжали мыши сетчатки в течение 2 дней. Мыши труднее, потому что сетчатка являются васкуляризированной, а также толще, чем кролик сетчатки.

3. Как мне убедиться, что ваш сетчатки здоровых по истечении этого времени?

• Золотой стандарт записи от них. Ганглия клетки должны по-прежнему реагируют на свет. Вы должны защитить вашу ткань от света во время инкубации, чтобы избежать отбеливания фотопигмент, потому что вы должны анализировать сетчатки от пигментного эпителия для инкубации.
• Иногда мы также использовали записи микроэлектрода массив для проверки нашей сетчатки.

4. Почему вы хотите управлять только несколько клеток в сетчатке за один раз?

• Некоторые вопросы не могут быть решены иначе. Рассмотрим, например, ГАМК рецепторы ганглиозных клеток. Вы можете использовать ГАМК-блокаторы, но вы бы подавлять все ГАМКергических передачи в сетчатке, а не только вход в клетку вы заинтересованы Это может быть очень трудно отличить влияние на эту ячейку, в частности, и в целом "сетевой эффект "В целом сетчатке.
• Если вы хотите увидеть морфологии ясно, что вы не можете маркировать все клетки, в противном случае вы просто получите беспорядок.

5. Является ли этот метод подходит в качестве населения пятно?

• Количество генов торкрет является случайной процедуры. Вы получите много ганглиозных клеток, многие перемещенные amacrine клеток, некоторые клетки Мюллера, и уж тем более всех других типов клеток.

6. Есть ли какие "уловки" Я должен знать, чтобы заставить ее работать?

• Не совсем так. Но важно, что вы делаете рассечение сетчатки довольно быстро, так что у вас есть штук на фильтр менее чем за 30 минут. Части не должны быть слишком маленькими, около одного квадратного сантиметра в порядке. Ожидайте 3-4 шт от одного кролика глаз.
• Храните ваши инструменты вскрытия строго от всего, что входит в контакт с фиксаторов и других агрессивных химикатов.
• Попробуйте настроить инкубаторе до 35 С, а не 37, так что сетчатке никогда не становится слишком жарко.
• Вам не нужно добавлять факторов роста, как BDNF к среде, по крайней мере, не делайте это регулярно, но вы должны использовать N2 добавка, 1% лошадиной сыворотки и антибиотики. Мы предоставляем список всех вещей, которые вы и будете нуждаться в качестве дополнительного файла в этой документации.

7. Не могли бы вы гена-пушечный другие вещи, а не плазмиды?

• Да, мы использовали краситель-сопряженных декстранов или DII и Дио. Но вы могли бы использовать кальций-индикатор красителей, или почти все, что вы можете пальто на золотые или вольфрамовые пули.

8. Каковы ограничения?

• Прежде всего, времени. Вам придется делать зрительного нерва, а это значит, что ганглиозные клетки в конечном итоге вырождается. Это не проблема на срок до 6 дней, но после этого мы не стал бы доверять сетчатки больше. Теперь, если вы просто хотите, чтобы выразить GFP или какой-либо другой клетке заполнения маркер, инкубации 2-3 дней вполне достаточно, но в некоторых случаях, например, когда вы хотите выразить тормозные РНК, эффект может иметь 4 и более дней шоу. Здесь, вы должны иметь в виду сроки.

9. Какие работы других исследователей следует ли быть в курсе?

• В сетчатке поле, конечно, лаборатория Рэйчел Вонга в Университете Вашингтона. Там также много работы, люди сделали в других системах, например, гиппокамп подготовки срез. Мы не претендуем, чтобы иметь возможность дать полный обзор литературы, но проверить документы в списке ссылок.