عضوي النمط من الثقافة الشبكية أرنب الكبار

هذا المقال يوضح تشريح وحضانة للشبكية الأرانب والجسيمات بوساطة نقل الجينات من البلازميدات GFP ترميز أو مجموعة متنوعة من العلامات التحت خلوية إلى خلايا الشبكية العقدة.

نظم الثقافة عضوي النمط من الأنسجة العصبية الوظيفية هي أدوات هامة في مجال البحوث العصبية الحيوية. من الناحية المثالية ، ينبغي أن يكون هذا النظام متوافق مع تقنيات التصوير ، والتلاعب الجيني ، وتسجيل الكهربية. هنا نقدم نسيج الطور البيني نظام بسيط للثقافة الشبكية الأرانب الكبار الذي لا يتطلب أي معدات متخصصة وصيانة قليلة جدا. نحن لشرح تشريح وحضانة للشبكية الأرانب والجسيمات بوساطة نقل الجينات من البلازميدات GFP ترميز أو مجموعة متنوعة من العلامات التحت خلوية إلى خلايا الشبكية العقدة. شبكيات الأرانب مثقف يمكن أن تبقى على قيد الحياة بهذه الطريقة لمدة تصل إلى 6 أيام مع تغييرات قليلة جدا من بنية تشريحية أو التشكل العام للدول ، فرادى وخلايا العقدة عديم الاستطالات.

صنع رصاصات بندقية الجينات (GOLD)

1. جعل 100X PVP (0.5mg/ml) في EtOH 100 ٪.
2. تزن خارج 30mg من 1.6 ميكرون microcarrier BioRad الذهب ووضعه في أنبوب 1.5 مل إيبندورف.
3. حساب كمية البلازميد اللازمة لإعطاء تركيز الذهب البلازميد 0،5-3 ميكروغرام / ملغ ، ووضع البلازميد في أنبوب مع microcarriers الذهب. الجمع بين عدة البلازميدات إذا لزم الأمر.
4. جلب حجم البلازميد الى 100 ميكرولتر مع الماء المقطر.
5. إضافة 100 ميكرولتر من سبيرمدين 0.05M في الأنبوب. دوامة أنبوب 30 ثانية.
6. دوامة 1 دقيقة بسرعة كاملة. يصوتن لمدة 3-5 دقائق..
7. جافة طول المناسب للأنابيب Tefzel في جهاز PDS-1000/He Biorad لمدة 15 دقيقة.
8. بعد صوتنة ، لمدة 1-2 دقائق دوامة بأقصى سرعة. خفض السرعة ببطء للسماح بفتح أنبوب بينما vortexing.
9. إضافة 100 ميكرولتر من CaCl M 1 ₂ ببطء إلى الانخفاض في حين vortexing أنبوب الحكيمة.
10. ترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
11. جعل 5 ميكرون تصفية.
    1. يستغرق عامين المحاقن 5ml دون الإبر.
    2. إزالة المكبس ، وفصل القبعات السوداء. أخذ مقص صغير ، وقطع جزء من الغطاء الأسود لإعطاء الحلبة. كرر على المكبس أخرى لالحلقتين الصافية.
    3. شطيرة مرشح 5 ميكرون (أجزاء صغيرة ، وشركة النايلون التصفية ، ونصف قطرها بوصة) بين الحلقتين ، ودفع شطيرة في رأس المحقنة.
    4. حقنة تتدلى على قارورة 50ml المخروطية.
12. بعد 10 دقيقة ، ودوامة أنبوب لمدة 30 ثانية.
13. أنبوب الطرد المركزي لمدة 30 ثانية ، وحفظ بيليه.
14. إضافة 1ml من EtOH 100 ٪ لبيليه. استخدام غيض ماصة لتفريق بيليه ، والدوامة 30 ثانية. تدور 30 ​​ثانية ، وإزالة EtOH. 2 كرر أكثر من مرة.
15. إضافة 1ml من EtOH 100 ٪ لبيليه (فاصل مع الطرف). هذا المكان في تصفية 5 ميكرون والسماح لها من خلال تدفق عن طريق الجاذبية في أنبوب 50ml المخروطية. EtOH استخدام أكثر حسب الحاجة لغسل خارج الأنبوب أو من خلال المساعدة في التدفق.
16. تدور في أنبوب 50ml 2000rpm في أجهزة الطرد المركزي لمدة 5-10 دقائق. إزالة طاف ، حفظ بيليه.
17. اعتمادا على الكثافة المطلوبة من microcarriers الحاجة ، إضافة 800μl - 1.5ml EtOH 100 ٪ و 8 - 15 ميكرولتر المقابلة حل PVP ميكرولتر.
18. دوامة وانتقل على الفور الى جهاز PDS-1000/He Biorad.
19. Biorad جهاز PDS-1000/He
    1. قطع الانبوب الذي يربط خزان الغاز في أنبوب N2 التجفيف
    2. إخراج التجفيف أنابيب Tefzel من الجهاز
    3. إدراج أحد طرفيه في أنبوب 50ml المخروطية ، وإرفاق حقنة إلى الطرف الآخر من الأنبوب. تمتص الطين البني في وسط الأنبوب.
    4. العودة الى ادخال أنابيب آلة.
    5. الانتظار (بدون التناوب) لمدة 4 دقائق
    6. بعد 4 دقائق ، تمتص قبالة EtOH ببطء وبعناية ، والتأكد من عدم الإخلال microcarriers.
    7. تدوير أنابيب لمدة 1 دقيقة.
    8. بعد 1 دقيقة ، وتوصيل أنبوب يربط خزان غاز N ₂ إلى أنبوب التجفيف والسماح أنابيب جافة لمدة 15 دقيقة.
20. بعد 15 دقيقة ، وقطع الأنابيب لحجم رصاصة لاستخدامها مباشرة أو تخزينها في 4 درجات مئوية في exsiccator. ويمكن تخزين الرصاص تصل إلى 3 أشهر.

إعداد مدفع الجينات

1. الرصاص في مكان خرطوشة. ويمكن اطلاق النار كل قطعة من شبكية العين مع الرصاص 1-3.
2. إدراج خرطوشة بندقية في الجينات ونعلق البندقية إلى مصدر الهليوم. تعيين الضغط الى 110 رطل.

إعداد وسائل الاعلام

1. تشريح المتوسطة
   
   

   1 زجاجة أميس الحل (سيغما ، 8.8g)

   بيكربونات الصوديوم 1.9 غم

   10 مل القلم 1 ٪ / بكتيريا / L - الجلوتامين (1:100) (Gibco / Invitrogen)

   990 مل ماء مقطر ل1L

   -------------------------------

   1 ليتر

   
   
   
2. تصفية المتوسطة تشريح باستخدام تصفية 0.22 ميكرون.
   
3. متوسطة الحضانة (500ml)
   
   

   485 مل من وسائل الاعلام التشريح التي تمت تصفيتها

   5 مل من تكملة N2 1 ٪ (Gibco / Invitrogen)

   1 ٪ 10ML مصل الحصان (سيجما)

   500 ميكرولتر من أحمر الفينول

   -------------------------------------------------- --

   0.5 لتر

   
   
   
4. تصفية المتوسطة حضانة باستخدام تصفية 0.22 ميكرون.
5. فقاعة O ₂ في تشريح المتوسطة لمدة 15 دقيقة قبل بدء الحصاد بروتوكول الشبكية.

إعداد غرف الحضانة لشبكية العين

1. تحت غطاء محرك السيارة ، وملء 60 ملم عدة أطباق عميقة (غرف الحضانة ، نونك) مع 25 مل من المتوسط ​​الحضانة. عدد من الأطباق يعتمد على عدد من عطنإيناس اللازمة.
2. مكان موقف مرشح في كل صحن عميق. وينبغي أن لا يقتصر على نصائح جدا من موقف أن تغمرها المياه.
3. وضع جميع الأطباق في عمق الحاضنة حتى شبكية العين جاهزة.
4. ملء two 100 ملم أطباق بتري وتقديمهم إلى مقاعد البدلاء تشريح.

التحضير للشبكية الأرنب

1. التضحية أرنب وفقا لبروتوكولات المعمول بها. التالية لا يجب أن يتم تحت غطاء محرك السيارة.
2. مع مقص الزاوية ، أدخله وراء العين في تجويف العين من الأرانب ، وقطع الأغشية والأعصاب البصرية التي تعلق على العين.
3. رفع بلطف خارج العين وغسله مع وسائل الاعلام تشريح الاوكسيجين.
4. مكان العين (القرنية مواجهة) في البئر لتقطيع العين وإغلاق الغطاء.
5. ضع شفرة الحق أفقيا تحت الغطاء. في اقتراح واحد على نحو سلس ، واستخلاص عبر النصل العين لقطع القرنية ، مما يترك كوب العين.
6. باستخدام ملقط ، إزالة شبكية العين من تقطيع اللحم جيدا ووضعه على ورقة التصفية.
7. إزالة العدسة والجسم الزجاجي التي لقط منطقة قريبة من العصب البصري وقطعت وسحب إلى الوراء على ورق الترشيح. كرر عدة مرات حتى يتم إزالة ما يقرب من جميع الزجاجي ، ويتطلع العين بددت الكأس.
8. مكان كوب العين في طبق بتري مع وسائل الإعلام لغسل تشريح.
9. قطع كوب العين في العدد المرغوب فيه من قطعة (5 قطع كحد أقصى).
10. أخذ قطعة واحدة من كوب العين ووضعه تحت المجهر.
11. المشبك والصلبة والمشيمية معا برفق على حافة الشبكية باستخدام ملقط. مع من ناحية أخرى ، واستخدام فرشاة لتنظيف غرامة الصحيح بين المشيمية والشبكية.
12. باستخدام حركات قصيرة لطيف ، ندف الشبكية قبالة المشيمية حتى يصبح منفصلة.
13. قطع 1 بوصة قبالة ماصة نقل معقمة. استخدام هذا لتمتص شبكية العين والمكان الى طبق بتري المتوسطة حضانة لغسل.
14. باستخدام آخر ماصة نقل معقمة مع 1 بوصة قطع ، بعناية نقل الشبكية على مرشح ميكرومتر Millicell 0.4 (ميليبور لعدم وجود القطة : PICMORG50).
15. استخدام الفرشاة لشبكية العين وتوجيه العقدة مع الجانب الخلية التي تواجه صعودا.
16. تتسطح خارج شبكية العين بواسطة بالفرشاة برفق على حواف الشبكية. تقليل لمس طبقة الخلايا العقدية مع فرشاة قدر الإمكان.
17. إزالة الزائدة المتوسطة على تصفية مع نقل ماصة.
18. باستخدام الملقط ، ونقل التصفية الصعود إلى suctioner تعديلها. الاعتماد على suctioner 2-3 مرات لإزالة كافة المتوسطة الحضانة من مرشح.

العدة الجينات وحضانة للشبكية

1. تحت غطاء محرك السيارة ، ومكان كل واحدة من المرشحات التي تحتوي على شبكية العين ، على المدرجات التصفية في أطباق عميقة 60 ملم (غرف الحضانة).
2. تأكد من أن المتوسط ​​هو على اتصال مع الجانب السفلي من التصفية ، وأنه وسيلة لا تمتد على جانبي فلتر على شبكية العين. ينبغي للمرشح بمثابة واجهة بين شبكية العين والمتوسطة.
3. اطلاق النار على كل قطعة من شبكية العين مع اثنين من الرصاص. مكان مدفع الجينات مباشرة فوق الأنسجة ، وحوالي 3-4 سم بعيدا.
4. إخضاع جميع غرف الحضانة في الصعود إلى شاكر في 35-37 درجة مئوية الحاضنة.
5. استبدال المتوسطة حضانة في كل يوم. يمكن المحتضنة في الشبكية لمدة أقصاها 6 أيام.

1. ماذا يمكنني أن أفعل مع هذا الأسلوب؟

• انظر مورفولوجيا الخلايا بشكل واضح.
• تسمية الخلايا ليسجل منها.
• Overexpress البروتينات ، مثل PSD95 ، ولكن أيضا البروتينات الأخرى التي تعدل استجابة الخلية ، مثل القنوات الأيونية ، المستقبلات.
• أعرب الرناوات المثبطة.

2. كيف أحافظ على شبكية العين طويلة الكبار؟

• 4 أيام لا يشكل مشكلة بالنسبة الأرانب الكبار. بعد ستة أيام من الخلايا نظرة "مريضة" ، أي التراجع عن المحاور ، تشاهد تورم التشعبات وتسجيل ردود الضوء يصبح غير موثوق بها (فقط ~ تم العثور على 50 ٪ من الخلايا إلى أن تستجيب للضوء بعد ذلك الوقت.
• أبقينا الماوس شبكية العين لمدة 2 ايام. الفئران هي أكثر صعوبة ، لأن شبكية العين وأوعية دموية ، وأيضا أكثر سمكا من شبكية العين الأرانب.

3. كيف يمكنني التأكد من شبكية العين الخاص بك هو صحي بعد هذا الوقت؟

• معيار الذهب يسجل منها. وينبغي أن تتفاعل خلايا العقدة لا تزال خفيفة. يجب حماية النسيج الخاص من الضوء خلال احتضان لتجنب تبيض صباغ متبدل بالضوء ، وذلك لأن لديك لتشريح شبكية العين قبالة الظهارة الصبغية للحضانة.
• نحن أحيانا تستخدم أيضا microelectrode تسجيل لاختبار مجموعة شبكية العين لدينا.

4. ماذا تريد التلاعب فقط بضع خلايا في الشبكية في وقت واحد؟

• لا يمكن أن تعالج بعض الأسئلة على خلاف ذلك. تنظر لمستقبلات GABA مثيل على خلية العقدة. هل يمكن استخدام حاصرات GABA ، ولكن هل يمكن أن يعوق انتقال جميع GABAergic في شبكية العين ، وليس فقط مدخلا إلى الخلية كنت مهتما قد يكون من الصعب جدا أن نفرق بين التأثير على تلك الخلية على وجه الخصوص ، وعموما تأثيرات الشبكة " "على شبكية العين كلها.
• إذا كنت تريد أن ترى بوضوح التشكل ، لا يمكنك تسمية كافة الخلايا ، وإلا كنت مجرد الحصول على الطعام.

5. هذا هو الأسلوب المناسب وعدد سكانها وصمة عار؟

• رقم العدة جين هو إجراء عشوائي. ستحصل على خلايا العقدة كثير ، كثير الخلايا عديم الاستطالات المشردين ، وبعض خلايا مولر ، وأقل بكثير من كل أنواع الخلايا الأخرى.

6. هل هناك أي "الحيل" أود أن أعرف لجعله العمل؟

• لا حقا. ولكن من المهم أن تفعل تشريح شبكية العين بسرعة نسبيا ، بحيث يكون لديك قطع الخاص بك على تصفية في أقل من 30 دقيقة. ينبغي أن لا تكون قطعة صغيرة جدا ، حوالي واحد سنتيمتر مربع على ما يرام. نتوقع من العين 3-4 قطع الأرانب واحد.
• أدوات تشريح تبقي بعيدا تماما عن أي شيء يأتي في اتصال مع مثبتات ومواد كيميائية أخرى قاسية.
• حاول إعداد حاضنة الخاص إلى 35 درجة مئوية بدلا من 37 ، بحيث لم يحصل الشبكية حار جدا.
• أنت لا تحتاج إلى إضافة عوامل النمو مثل BDNF الخاص والمتوسطة ، على الأقل نحن لا نفعل ذلك بشكل روتيني ، ولكن يجب استخدام تكملة N2 ، 1 ٪ مصل الحصان ، والمضادات الحيوية. نحن نقدم قائمة في كل الامور التي كنت وسوف تحتاج كملف تكميلية لهذه الوثائق.

7. هل يمكن أن الجينات بندقية الأشياء الأخرى ، بدلا من البلازميدات؟

• نعم ، لقد استخدمنا صبغ dextrans مترافق أو الجاذبة وديو. ولكن هل يمكن استخدام الكالسيوم مؤشر الأصباغ ، أو أي شيء الى حد كبير يمكنك معطف على الرصاص أو الذهب التنغستن.

8. ما هي القيود؟

• بادئ ذي بدء ، وقتا. لديك لقطع العصب البصري ، مما يعني أن الخلايا العقدية سوف تتحول في نهاية المطاف. هذه ليست مشكلة لمدة تصل إلى 6 أيام ، ولكن بعد أن كنا لا نثق في أي أكثر من شبكية العين. الآن ، إذا كنت ترغب فقط في التعبير عن GFP أو بعض الخلايا ملء علامة ، والحضانة من 2-3 أيام كافية ، ولكن في بعض الحالات ، مثل عندما تريد التعبير عن RNAs والمثبطة ، وأثر يمكن أن يستغرق 4 أيام أو أكثر ل المعرض. هنا ، لديك للحفاظ على الجدول الزمني في الاعتبار.

9. فماذا عمل الباحث الآخر للمرء أن يكون على علم بها؟

• في مجال شبكية العين ، وبالتأكيد مختبر راشيل ونغ في جامعة واشنطن. هناك أيضا الكثير من الناس يعملون فعلت في أنظمة أخرى ، مثل إعداد شريحة الحصين. نحن لا ندعي أن تكون قادرة على إعطاء مسح كامل للالأدب ، ولكن تحقق من ورقات في قائمة المراجع.