Живая изображений глиальных миграции клеток в диск дрозофилы глаз имагинальных

Здесь мы опишем протокол для изучения миграции глиальных клеток в развивающихся дрозофилы глаз с использованием живых микроскопического анализа в паре с меткой GFP глиальных клеток.

Глиальных клеток обеих позвоночных и беспозвоночных организмов должны перейти на заключительный целевых регионов для того, чтобы ensheath и поддержки связанных нейронов. Хотя в последнее время прогресс был достигнут, чтобы описать живую миграцию глиальных клеток в развивающемся куколки крыло (1), исследования

Часть 1: Pre-экспериментальной установки.

1. Один неделю вперед, приятель мухи генерировать личинки, которые выражают GFP под контролем глиальных конкретных промоутера. Для нашего эксперимента мы визуализировали GFP с меткой ядерное последовательность локализации выраженных в глиальных клеток с использованием обратной полярности (РЕПО) промоутер (3, 4).
2. Подготовка крышка скользит по крайней мере один день, впитывая 18 мм скользит круглой крышкой в ​​течение 10 минут в 1% поли-L-лизин раствора и сухой воздух в одночасье.
3. За день до эксперимента, чистый Chamlide магнитной камеры культуры, впитывая компонентов на ночь в 70% этанола.
4. В день эксперимента, подготовить культуральной среде, добавив эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллин стрептомицин решение, и инсулина до 10 мл насекомых среды Шнайдера использованием асептических условиях. Рабочая концентрация: 1X эмбриональной телячьей сыворотки; 100U/ml пенициллина; 0.1mg/ml стрептомицин, и 0,2 мг / мл инсулина в насекомое среду Шнайдера (с изменениями от (5)).
5. Разрешить культуры камеры высохнуть на воздухе в капот культуре клеток. Смыть остаточного этанола из культуры камере промывки Готовую среду культуры.

Часть 2: Препарирование дрозофилы глаз-мозг комплекса.

1. Выбор третьего возраста блуждающих личинки со стороны флакона летать и место в капле охлажденной культуральной среды на чашку Петри на льду в течение нескольких минут. Охлаждение личинки рекомендуется медленное перистальтических сокращений тела для удобства вскрытия.
2. Место охлажденной личинки в капле питательной среды на Sylgard покрытием блюдо под рассечение микроскопом.
3. Под микроскопом рассечение, используйте пару Дюмон штраф щипцы твердо усвоить личинки примерно треть пути от заднего конца. Подождите, пока личинка выдавливает его крючки рта от переднего конца. Возьмитесь рот крючки с второй парой щипцов при полном разгибании. Чтобы вскрыть личинка, медленно вытяните две пары щипцов в противоположных направлениях. Глаз-мозг комплекса, а также слюнные железы, жир тела, и имагинальные ткани, будет тянуть в сторону от тела личинки. Не тяните рот крючки слишком быстро, иначе они будут отрывать от глаз-мозг комплекса.
4. Trim от слюнных желез, жира тела, и имагинальные диски, используя ультра-тонкой ножницы клипер. Двух полушарий мозга и глаз-диски будут прикреплены к брюшной нервной и рот крючков.
5. Место 18 мм покрытие скольжения на предметное стекло. Оставьте один край покровным стеклом висит у края слайда, чтобы позже забрать покровным стеклом. Добавить каплю питательной среды на 18 скольжению покрытие мм. Передача глаз-мозг комплекса в культуральной среде, держа рот крючка щипцами. Не понять глаз-мозг комплекса непосредственно с пинцетом или ткани будет поврежден.
6. Использование тонких ножниц вскрытия, обрезать рот крючки из глаз-мозг комплекса и выбросьте. Удаление рот крючки важно для живого изображения, как рот крючки будут продолжать сокращаться в культуральной среде, вызывая ткани для перемещения во время микроскопии.
7. Для визуализации глиальных миграции внутри глаза имагинальных дисков, тщательно вырезать глазного стебля, тонкие ткани, которая соединяет мозг и глаза диска и отталкивать или отказаться от головного мозга (см. рисунок 1А). Для визуализации глии в глазной стебель, оставьте мозга, глазного стебля, а глаза имагинальных дисков без изменений (см. рис 1E).
8. Возьмите покровное использованием щипцов и нарисуйте круг вокруг под тканью, с перманентным маркером. Этот круг будет помогать в поиске ткани для микроскопии в части 4.

Часть 3: Монтаж глаз имагинальных дисков в магнитном камере культуры.

1. Использование щипцов, держитесь висит краю покровного стекла. Передача покровное к нижней пластине Chamlide магнитной камеры, не нарушая ткани в культуре.
2. Место силиконовые уплотнительные кольца на корпусе камеры Chamlide. Установите основной части в верхней части нижней панели.
3. Медленно добавляйте питательной среды для камеры. Не добавляйте в культуральной среде, слишком быстро или тканью, будет нарушен. Не полностью заполнить камеру для обеспечения газообмена под крышкой.
4. Аккуратно невидимой крышкой на верхней части камеры Chamlide.

Часть 4: Визуализация мигрирующих глиальных клеток в глазу диска.

1. Место культуры камеру на сцене конфокальной или флуоресцентного микроскопа. Найдите примера с использованием круга на покровное как ссылка на малом увеличении.
2. Сосредоточьтесь на образец с помощью 40x объектива. Разрешить ткани оседают на покровное. Захват изображений на диске глаза или глазной стебель через каждые 10-15мин в течение 3-4 часов. Ткань может дергаться и двигаться не в фокусе. Ручная фокусировка ткани до захвата изображения снимет йявляется проблемой.

Часть 5: Представитель результаты:

Выполнены правильно, наш протокол позволил нам собрать серию изображений GFP с метками глиальных клеток, которые мигрировали из глазного стебля в глаз имагинальных дисков (рис. 1 BD). Хотя жить изображений для 60-минутного периода, было достаточно, чтобы наблюдать за изменениями в позициях глиальных ядер внутри дикого типа глаз имагинальных дисков, глиальных ядер в мутанта для гена необходимые для миграции клеток глии совершенно не выход глазного стебля (стрелки Рисунок 1 FH).

У нас есть культурный глаз-мозг комплексов на период до тех пор, как 240 минут до наблюдения ухудшение культурного ткани. После 240-минутный временной точке мы начинаем наблюдать GFP-положительных клеток в культуральной среде окружающего культурного глаз-мозг комплексов (стрелка Рисунок 2 C). Кроме того GFP будет накапливаться в расплывчатых пятен по всему тканей предположить нарушение целостности тканей.

Рисунок 1: Live изображений GFP с метками глиальных ядер в развивающихся дикого типа и мутантных визуальных систем.
, Е) Изображения, полученные с помощью дифференциальных интерференционного контраста (DIC) микроскопии культурного дикого типа и мутантных глаз имагинальных дисков (ЭД). В дикого типа, глиальные клетки рождаются в и мигрируют из глазного стебля (ОС) в глаз-диска. Мозга была удалена, чтобы облегчить выравнивание и визуализации глаз имагинальных дисков. BD) Флуоресцентная микроскопия дикого типа культурный глаз имагинальных дисков в (А) при 0, 30 и 60 минут моменты времени показывает, GFP с метками глиальных ядра мигрируют внутри глаза диска.

FH) Флуоресцентная микроскопия мутантного глаз-мозг комплекса в (E) при 0, 30 и 60 минут моменты времени демонстрирует пробуксовки GFP с метками глиальных ядер внутри глазной стебель (стрелка). Мозга (БР) был оставлен прилагается к глазной стебель для облегчения визуализации глии в стебле.

Рисунок 2: Живая съемка GFP с метками глиальных мембран в дикого типа глаз имагинальных дисков. Мы успешно культурный глаз-мозг комплексов для 240-минутных периодов. Ткань культурные дольше, чем 240 минут начинает разрушаться. Культуральной среде окружающих глаз имагинальных дисков (ЭД), глазного стебля (ОС), и мозг доли (БР) на 0 () и 150 минут (В), по сравнению с 300 минуты временной точке (С), свободна из GFP-положительных клеток, указывает стрелка.

В этом протоколе описываются наблюдения миграции клеток глии в глаз имагинальных дисков с использованием живых микроскопии. В нашем примере дикого типа (рис. 1 г. н.э.), мы использовали ядерное маркера GFP наблюдать глиальных движения ячейки в глазу диск в течение одного часа. В мутанта для генов-кандидатов, необходимые для миграции клеток глии в настоящее время изучается в нашей лаборатории, мы наблюдали срыва глиальных клеточных ядер в пределах глазной стебель течение одного часа (рис. 1 ГБ). Наша стратегия может быть адаптирована к себе более подробно клеточных поведение регулируется нашими гена. Например, мембраны целевых GFP молекулы, такие как mCD8-GFP, может быть выражена в глии для визуализации клеточных процессов. Использование мембраносвязанных маркера GFP позволит нам определить, если глиальных клеток в нашем мутанты способны расширения клеточных процессов, таких как филоподий в глаз диска. Аналогично актина с меткой GFP или тубулина с меткой GFP может быть выражена в развивающихся глии для визуализации изменения цитоскелета во время миграции клеток глии. Кроме того, рассмотрение одного GFP меченных мутантов глиальные клетки могут быть визуализированы с использованием живых микроскопии (6). Эта техника позволит нам более точно описать требования для наших интересующего гена в регулировании миграции глиальных клеток.

The authors have nothing to disclose.

Патрик Кафферти поддерживается докторской стипендий, начиная с нескольких общества рассеянного склероза Канады.