Nossa pesquisa avalia os comportamentos de higiene em Drosophila melanogaster após knockdown de Atg8a mediado por RNAi para modelar os déficits de GABARAP observados em pacientes com síndrome de Tourette. Nosso objetivo é entender o papel do aAtg8a no desenvolvimento comportamental, fornecendo insights sobre as funções regulatórias de sua contraparte humana nos processos neurocomportamentais. Os desafios experimentais atuais com o método de anotação manual incluem o complexo processo analítico, como anotar e revisar imagens, e a subjetividade envolvida na anotação manual.
Os métodos automatizados também enfrentam desafios, incluindo a necessidade de conhecimento substancial em ciência da computação para implementar e executar com eficiência. Descobrimos que o gene Atg8a desempenha um papel no desenvolvimento do comportamento em moscas-das-frutas além do que foi estabelecido anteriormente. Mais especificamente, descobrimos que ele regula tanto a preparação quanto o aprendizado, sugerindo que os ortólogos Atg8a podem desempenhar papéis semelhantes em outros organismos.
Esta técnica permite a quantificação direta da frequência e distribuição de aliciamento em Drosophila. É especialmente útil em laboratórios incapazes de utilizar métodos automatizados e permite uma análise mais detalhada do que os métodos indiretos baseados em corantes. No geral, nossa pesquisa avança o uso de Drosophila como um organismo modelo para estudar distúrbios do neurodesenvolvimento que exibem comportamento obsessivo-compulsivo, como a síndrome de Tourette.
Também aumenta a evidência crescente de que as proteínas relacionadas à autofagia desempenham um papel no desenvolvimento comportamental. Para começar, coloque quatro pratos de três poços lado a lado em uma superfície branca e cubra cada prato com uma lâmina de vidro. Posicione uma câmera acima dos pratos.
Certifique-se de que não haja brilho nas lâminas que possa limitar a visibilidade das moscas no prato e ajuste a posição da placa ou diminua as luzes conforme necessário para eliminar o brilho. Agora marque a posição dos pratos e da câmera na bancada onde a gravação está ocorrendo. Coloque moscas de quatro a nove dias em um bloco de gelo coberto com parafilme e uma toalha de papel para anestesiá-las levemente.
Uma vez anestesiadas, mova as moscas para as câmaras de observação o mais rápido possível usando um pincel. Coloque uma mosca em cada poço do prato de três poços, garantindo o mínimo de perturbação para evitar provocar mudanças de comportamento induzidas pelo estresse. Depois de aclimatar as moscas 30 minutos após a anestesia, registre as moscas usando uma câmera, abra o terminal e digite cd PiSpy.
Digite python3 PiSpy. py e insira a duração de gravação e a taxa de quadros desejadas. Selecione a resolução desejada e clique em Captura rápida.
Agora use a função Preview Camera no Pi Spy para garantir que as moscas estejam em foco e suficientemente visíveis. Grave as moscas por 10 minutos a uma taxa de quadros recomendada de 24 quadros por segundo e salve o arquivo. Para analisar o vídeo, importe o arquivo para o software ELAN 6.8 para anotação detalhada e análise aprofundada dos comportamentos de limpeza.
Selecione Tier, Add New Tier, digite location no prato no nome da camada e add para atribuir cada linha para anotar manualmente a filmagem de indivíduos. Para anotar comportamentos, clique duas vezes na camada a ser anotada, clique com o botão direito do mouse e arraste o cursor ao longo da camada selecionada por um período durante o qual uma única sessão de limpeza é exibida. Clique com o botão esquerdo do mouse para selecionar a nova anotação e clique duas vezes no período de tempo recém-destacado para digitar a abreviação do comportamento observado naquele ponto de tempo.
Depois que o vídeo estiver completamente anotado, obtenha um detalhamento de cada comportamento clicando em Exibir, seguido de Estatísticas de anotação. Identifique a preparação anterior como a limpeza realizada na região anterior do corpo da mosca. Identifique a preparação posterior como a limpeza realizada na extremidade ântero-posterior do corpo da mosca.
As sessões de aliciamento aumentaram significativamente em mutantes de RNAi Atg8a em comparação com os grupos de controle. O tempo gasto na preparação também foi significativamente elevado em mutantes de RNAi Atg8a em comparação com os controles. Não foram observadas diferenças significativas na distribuição dos comportamentos de higiene anterior versus posterior.
