Estamos projetando um ensaio para avaliar a função plaquetária em ambientes fisiológicos, para abordar a limitação dos ensaios atuais, ativando as plaquetas em um microambiente semirrígido com um sensor de capacidade de membrana. O ensaio mede a contagem de plaquetas, a força de estimulação e as vias de ativação. Esta ferramenta oferece uma abordagem abrangente para estudar os mecanismos plaquetários durante a hemostasia.
Nosso protocolo pode avaliar múltiplos parâmetros da plaqueta no ensaio único em condições fisiológicas. Vamos nos concentrar no aprimoramento deste protocolo e no desenvolvimento de outros sensores de avaliação de hemostasia. Comece usando o software de layout CAD padrão para projetar o layout do chip de capacitância de membrana da equipe, ou MCC, para um substrato de wafer de silício de quatro polegadas para o processo de microfabricação, conforme descrito no manuscrito.
Para biofuncionalização, limpe o eletrodo sensor de TMCC usando plasma de oxigênio por 45 segundos a 100 watts. Adicione uma solução Do Decanal em etanol à prova de 200 ao poço de amostra nos TMCCs. Coloque os TMCCs em um recipiente cheio de nitrogênio seco.
Feche o recipiente e envolva-o com parafilme por 24 a 48 horas. Após dois dias, enxágue a superfície dourada do TMCC com água deionizada e etanol 200 proof. Seque os TMCCs com gás nitrogênio em temperatura ambiente.
Adicione a solução de fibronectina humana em PBS ao poço de amostra de TMCC e incube a 37 graus Celsius por duas a oito horas. Para a configuração do sensor de capacitância, use um medidor LCR com microposicionadores e sondas de agulha para estabelecer contato elétrico com o sensor. Empregue acessórios de plástico impressos em 3D para colocar com segurança o TMCC e o BMCC.
Certifique-se de que o acessório inferior esteja equipado com rolhas no eixo XY para alinhar o TMCC com precisão sobre o BMCC, formando um capacitor. Aplique um sinal senoidal de 0,5 volts a 100 kilohertz com uma taxa de amostragem de oito hertz. Para obter plasma rico em plaquetas concentrado, ou CPRP, centrifugue as amostras de sangue humano.
Transfira o CPRP para um recipiente estéril e conduza a contagem de plaquetas. Para estudos de inibidores, incube o CPRP com uma concentração predefinida de aspirina no tampão de Tyrode. Para o ensaio funcional de plaquetas, monte TMCC e BMCC nos acessórios impressos em 3D.
Meça a capacitância basal dos CCMs montados por cinco minutos, adicione 45 microlitros de CPRP ao poço da amostra no TMCC e aguarde 30 minutos para permitir que as plaquetas adiram ao eletrodo revestido com fibronectina no TMCC. Em seguida, remova 30 microlitros de CPRP do poço de amostra sem perturbar as plaquetas aderidas e reabasteça o poço com o tampão de Tyrode. Após a última lavagem, adicione 10 microlitros da solução agonista na concentração desejada e equilibre a amostra por 80 minutos.
Meça a mudança máxima na capacitância após a adesão de 30 minutos para determinar a adesão delta C. Para a fase de ativação, meça a mudança máxima na capacitância, conhecida como ativação delta C. Calcule a inclinação da curva de capacitância entre 200 e 300 segundos após a ativação para determinar a ativação de S.
Realizar análise estatística usando análise de variância com teste pós-operatório de Tukey para comparar os resultados entre os grupos. Use a qualidade do ajuste de Shapiro-Wilk para testar a distribuição normal. Uma solução de CPRP com uma contagem de plaquetas predeterminada mostrou uma diminuição linear na capacitância durante a adesão.
Uma diminuição exponencial do estado estacionário foi observada após a ativação da trombina. Os valores de adesão do Delta C mostraram uma forte correlação com a contagem de plaquetas em uma variedade de contagens de plaquetas, com uma redução significativa na concentração de aspirina de 1,3 milimoles. A taxa de diminuição exponencial da capacitância após a estimulação plaquetária aumentou com a concentração celular.
A magnitude da perda de capacitância também cresceu com concentrações mais altas, mostrando uma clara tendência ascendente na ativação do delta C. Uma tendência semelhante foi observada para a ativação de S e contagem de plaquetas. Com o aumento da dose de aspirina, a capacitância, a ativação do delta C e a ativação do S mostraram tendências decrescentes.
Foi observada diferença estatisticamente significativa na ativação de S entre doses altas e médias, enquanto nenhuma diferença significativa foi encontrada na ativação do delta C. Os sinais de capacitância para amostras de CPRP ativadas com trombina mostraram que a redução da capacitância tornou-se mais pronunciada com o aumento da concentração de trombina. Tanto a ativação delta C quanto a ativação S exibiram uma tendência estatisticamente significativa com os níveis de trombina.
