Bem-vindo aos nossos guias de vídeo para oclusão transitória da artéria cerebral média em camundongos. Meu nome é Rok Ister, e este experimento ocorreu no Laboratório de Neurociência Regenerativa da Escola de Medicina da Universidade de Zagreb. O método da artéria cerebral média transitória, ou tMCAO, é o modelo animal mais comumente usado de acidente vascular cerebral isquêmico.
É feito predominantemente em roedores, como ratos e camundongos. Dois métodos operatórios principais, a artéria carótida comum e o método da artéria carótida externa, diferem principalmente pelo local da arteriotomia para inserção do filamento. Neste vídeo, apresentaremos nossas modificações e alguns pontos-chave para garantir a reperfusão completa usando o método da artéria carótida externa.
A partir das ferramentas recomendadas, você precisará de duas pinças Dumont tipo 5, pinças Dumont tipo 7 e pinças de fechamento automático Dumont tipo N0, um afastador mini-colibri e uma tesoura de micromola reta para arteriotomia. Para a hemostasia, usaremos duas micropinças vasculares juntas, com um respectivo aplicador. Tesoura cirúrgica, porta-agulha e pinça cirúrgica, usaremos para abrir e fechar a ferida cirúrgica.
Para materiais, usaremos sutura de monofilamento 5/0 para ferida cirúrgica e sutura de seda trançada 6/0 para ligaduras arteriais, fita cirúrgica para fixação do animal, gel de pomada para os olhos dos animais e gel de lidocaína para anestesia local adicional. Por fim, para drenar o excesso de sangue, usaremos pedaços pontiagudos de uma toalha de papel. Um microscópio cirúrgico estéreo é crucial para um procedimento microcirúrgico como este.
Roedores anestesiados são propensos à hipotermia, então usaremos um monitor de temperatura. No lado operacional do animal, você precisará de uma superfície aquecida e fácil de limpar, juntamente com um tubo de suprimento de gás anestésico e uma maneira de monitorar de forma confiável a temperatura do animal durante o procedimento. Na mesa à esquerda, há mais algumas ferramentas e materiais que usaremos.
A medição da duração de certas partes do procedimento é muito importante por razões de reprodutibilidade, bem como a análise posterior dos dados. Desinfetante de pele Betadine e seringas carregadas para uso rápido e fácil. Máquina de cortar pêlos de animais para raspar o pelo do animal.
Uma balança, importante para a dosagem correta da anestesia. E, por último, um sistema de anestesia com gás animal capaz de fornecer uma mistura de gás nitrogênio-oxigênio na proporção de 2:1, juntamente com uma caixa de nocaute para indução anestésica. Todo o manejo e procedimentos dos animais apresentados neste vídeo foram aprovados pelo Comitê de Licenciamento de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Zagreb e feitos por pessoal treinado e licenciado. Protocolo.
Preparação do animal e do sítio cirúrgico. Posicione o animal na mesa de operação aquecida e coloque o nariz na máscara de anestesia. Aplique pomadas nos olhos dos animais para protegê-los da hidratação e do uso do gás flúor.
Vire o animal de costas e estenda-o o pescoço colocando um pequeno travesseiro, feito de fita cirúrgica, embaixo do pescoço do animal. Prenda os membros do animal no lugar usando fita cirúrgica. Tome cuidado para não estender muito os membros anteriores, para não causar inadvertidamente luxação da articulação do ombro.
Lubrifique a sonda retal usando vaselina branca e insira-a no reto para medição contínua da temperatura corporal. Aplique uma injeção pré-operatória de solução salina e buprenorfina, por via intraperitoneal, para manter o animal bem hidratado e sem dor durante o procedimento. Molde o pelo do animal na região do pescoço usando o cortador de animais sem fio.
Colete todo o pelo raspado usando pedaços de fita cirúrgica. Para deixar a área completamente livre de pelos, molde adicionalmente a região com a navalha. Coloque uma cortina cirúrgica limpa sobre a mesa de operação.
Aplique uma gota de Betadine na pele raspada do animal. Use um cotonete para esfregar o desinfetante na pele de forma circular de dentro para fora. Depois, faça o mesmo com um cotonete embebido em etanol.
Repita esta etapa três vezes com um novo par de cotonetes estéreis para cada repetição. Aplique um pouco de gel de lidocaína na região desinfetada do futuro local da incisão para analgesia local da ferida. Cirurgia de indução de isquemia.
Fazendo uma incisão inicial na pele desinfetada usando um bisturi, mantenha o número de golpes de incisão na pele no mínimo para facilitar a cicatrização da ferida cirúrgica. Usando pinças tipo 7 e 5, rasgue a fáscia superficial e retire as glândulas salivares do tecido subjacente. Coloque o afastador de fio em sua posição inicial, certificando-se de que as glândulas salivares não atrapalhem as etapas subsequentes.
Remova a fáscia profunda do pescoço usando uma pinça tipo 7 e descole os músculos esternocleidomastóideos da região carotídea para reposicionar o afastador. Reposicione o afastador para alcançar os músculos esternocleidomastóideos para permitir o acesso à região carotídea. Ressece o músculo omo-hióideo para permitir uma visão clara e uma abordagem mais fácil da região carotídea.
Aperte a fáscia carotídea no lado lateral da tríade carotídea e puxe-a suavemente lateralmente para identificar visualmente a artéria, o nervo, a veia e todos os ramos dos vasos sanguíneos circundantes. Separe completamente a parte inferior do CCA do tecido subjacente e da fáscia usando uma pinça curva tipo 7, certificando-se de que esteja pronta para clampear em etapas futuras. Com o CCA cuidadosamente preparado junto com seus dois respectivos ramos, levante o ECA usando uma pinça curva tipo 7 e prenda-o com uma pinça de fechamento automático tipo N0 Com o ECA clamped e preso firmemente com pinças tipo N0, introduza dois fios de seda trançados atrás do ECA.
Amarre o fio craniano completamente, pois é permanente, e prenda o excesso de fio com uma tesoura. Amarre o fio caudal em um nó solto. Usando microclipes vasculares, aperte o CCA e o ICA para evitar qualquer sangramento após a arteriotomia.
Usando uma tesoura de micromola, faça uma pequena arteriotomia logo abaixo do local de fixação do ECA. Com um ângulo correspondente ao do ECA, insira o filamento no local da arteriotomia em uma direção proximal ao CCA, passando pelo nó de fixação frouxo no lado ramificado do ECA e aderindo ao lúmen do CCA com o filamento. Abra cuidadosamente o microclipe ICA e remova-o.
Com o filamento parcialmente inserido no ECA e preso, faça uma arteriotomia completa, soltando assim o coto do ECA com o filamento MCAO dentro. Neste ponto, solte a pinça de fechamento automático tipo N0 e remova-a. Com um conjunto de pinças tipo 5, aperte firmemente o coto ECA e levante-o ligeiramente.
Enquanto segura o filamento parcialmente inserido com outra pinça, abaixe e puxe suavemente o coto ECA para orientar a extremidade interna do filamento em direção ao ICA. Nunca aperte a parte de silicone do filamento. Avance lentamente o filamento MCAO através do Círculo de Willis até sentir um aumento repentino na resistência.
Neste ponto, é importante observar o comprimento restante do filamento. Em um camundongo adulto, o filamento deve prosseguir sem esforço a pelo menos sete milímetros do ponto de ramificação do ICA. Aperte o nó de fixação para garantir que o filamento não se desloque durante o período de isquemia.
Remova o clipe CCA e anote a hora, isso marca o início do início da isquemia. Remova o afastador de fio e aproxime as bordas da ferida cirúrgica. Deixe o local da cirurgia assentar por alguns segundos para que o tecido retorne à sua posição anatômica.
Feche a ferida cirúrgica usando fechos de fita adesiva para facilitar a reabertura mais rápida da ferida após o período de isquemia. Período de isquemia. Valide o sucesso da cirurgia usando ressonância magnética ou algum outro método quantitativo de medição de perfusão.
Cirurgia de retirada de filamentos. Remova os fechos da fita e reabra a ferida cirúrgica com o afastador de fio. Com uma pinça tipo N0, aperte e puxe a borda do coto ECA ventralmente para colocar a tensão no coto ECA.
Clamp o CCA novamente com um clipe macrovascular. Retire lentamente o filamento MCAO até o ponto em que a parte de silicone do filamento começa a sair do toco ECA. Aperte ligeiramente o nó de fixação para se preparar para a retirada completa do filamento.
Quando estiver perto da extremidade de silicone do filamento, aperte o nó de fixação de forma que empurre o filamento MCAO para fora e feche o coto ECA em uma única manobra. Aperte o nó completamente depois que o filamento escorregar. Abra e remova a pinça de aperto junto com o clipe CCA.
Suturar a ferida cirúrgica, começando pela periferia, fechando completamente a ferida sem nenhum tecido subjacente visível. O número de suturas necessárias depende do tamanho da ferida cirúrgica. Limpe e desinfete o local da cirurgia usando lenços umedecidos com álcool.
Resultados representativos. Após um procedimento bem-sucedido, os resultados dos exames de ressonância magnética devem ser semelhantes a este. No intraoperatório, durante o período de isquemia, você deve ser capaz de observar uma região nítida com isquemia nas imagens ponderadas em perfusão.
A lesão do coeficiente de difusão aparente deve cobrir aproximadamente a mesma área. No pós-operatório, após a retirada do filamento, o ideal é observar o núcleo da lesão hiperperfundido nas imagens ponderadas em perfusão. Com exceção do núcleo isquêmico, você deve ver recuperação e leve ultrapassagem nos valores de ADC na lesão.
No segundo dia após o procedimento, a lesão deve ser reperfundida completamente. Os valores de ADC devem cair novamente no núcleo da lesão isquêmica devido ao edema cerebral, que também deve ser visível na imagem T2. No caso de hemorragia induzida por filamento, não é observada melhora na perfusão ou nos mapas de ADC no pós-operatório.
Além disso, um sinal claro de hemorragia pode ser observado nas imagens T2, tanto no intraoperatório quanto no pós-operatório. Conclusão. Graças a estudos anatômicos recentes da vasculatura cerebral de camundongos, podemos ajustar e modificar nosso modelo MCAO com base no novo conhecimento. As artérias comunicantes posteriores, pintadas de verde, são patentes bilateralmente em apenas 10% das cepas de camundongos mais comumente usadas.
Por esse motivo, eles podem ser usados para fornecer fluxo sanguíneo aos ramos proximais da MCA. Assim, o CCA precisa ser mantido patente durante o período de isquemia, e a parte de silício do filamento não deve exceder três milímetros de comprimento. Esperamos ter sido informativos e concisos neste vídeo.
Obrigado por assistir.
