Este protocolo permite o isolamento de compostos de moluscos com propriedades anti-criptocócicas. Esta técnica oferece uma abordagem imparcial para identificar e isolar compostos de moluscos com propriedades potenciais, incluindo matar os patógenos fúngicos humanos. Existem outros compostos, como os inibidores da protease do HIV, sendo usados para tratar pacientes com HIV.
No entanto, a expansão para outros patógenos, bem como a investigação de fontes naturais, representam novos caminhos de descoberta. A última etapa é a etapa mais difícil, pois as amostras podem não ser filtradas. Como resultado, as amostras podem precisar ser diluídas para filtragem.
Comece coletando moluscos como Cipangopaludina chinensis de uma área natural designada e aprovada. Selecione espécies nativas e invasoras para avaliar uma ampla gama de potenciais efeitos antifúngicos. Quebre suavemente a casca do C.chinensis usando um pilão e argamassa e remova os pedaços sólidos com um par de pinças.
Geralmente, 10 moluscos são agrupados para o protocolo. Coletar e pesar aproximadamente 15 a 20 gramas da amostra e usar tesoura para cortar os órgãos em pequenos pedaços de aproximadamente 0,5 a um centímetro de tamanho. Congelar rapidamente as amostras de órgãos dissecadas e cortadas usando nitrogênio líquido antes de moer as amostras de órgãos em um pó fino usando um pilão e argamassa.
Uma vez feito, adicione aproximadamente 15 gramas do pó da amostra do órgão a 30 mililitros de água destilada fria para atingir uma proporção de um para dois. Despeje dois mililitros da amostra em tubos de dois mililitros de alto impacto e adicione aproximadamente 500 microgramas de contas de aço inoxidável de três milímetros a cada tubo. Homogeneize por três minutos a 1.200 RPM em quatro graus Celsius usando um liquidificador de balas ou batedor de contas.
Centrifugar o tubo a 12.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Recolha o sobrenadante num tubo fresco de 50 mililitros e descarte o pellet. Filtrar esterilizar o sobrenadante utilizando uma membrana de 0,22 micrómetros e armazenar as amostras em gelo antes de clarificar o extracto.
Coloque a amostra sobrenadante em um banho termal a 60 graus Celsius por 30 minutos e imediatamente resfrie-a transferindo a amostra para um balde cheio de gelo por 20 minutos. Centrifugar as amostras frias a 15.000 G durante 45 minutos a quatro graus Celsius. Recolha o sobrenadante num tubo fresco de 50 mililitros e descarte o pellet.
Filtre esterilize as amostras usando um filtro de membrana de 0,22 mícron e, em seguida, armazene-as no gelo. Uma vez feito, determine a concentração de proteína no bruto e nos extratos clarificados usando um ensaio de quantificação. A faixa de concentração ideal de proteína é de quatro a oito microgramas por mililitro.
Incubar as amostras no gelo por até uma hora ou congelar rapidamente em nitrogênio líquido antes de armazená-las a menos 20 graus Celsius até que seja necessário. Em uma placa de fundo plano de 96 poços, incubar 10 microlitros de quatro miligramas por mililitro de extrato de proteína de molusco bruto ou clarificado, 10 microlitros de subtilisina A, com uma concentração dentro da faixa linear medida, e 220 microlitros de cloridrato de tris milimolar de 8,6 pH por 10 minutos a 25 graus Celsius. Em seguida, adicione 10 microlitros de N-succinil-alanina, alanina, prolina, fenolanina, p-nitroanilina, o substrato para a subtilisina A, a uma concentração final de um KM para um volume de reação final de 250 microlitros.
Uma vez feito, meça a atividade enzimática monitorando a densidade óptica a 405 nanômetros a cada 15 segundos por três minutos. Certifique-se de que os poços sem extratos produzam uma curva reta durante a leitura. Para determinar a atividade enzimática residual, calcular a razão entre a atividade enzimática na presença de extrato de molusco e a ausência do extrato.
Se for observada atividade inibitória, meça a concentração inibitória 50 ou o valor de IC50 usando uma faixa de concentrações dos extratos. Introduzir uma única colônia de C.neoformans H99 tipo selvagem em cinco mililitros de extrato de levedura peptona dextrose ou meio YEPD usando uma ponta de pipeta de 10 microlitros e incubar por 16 a 18 horas a 30 graus Celsius e 200 RPM. Coletar 500 microlitros da cultura em uma cubeta e medir o crescimento lendo a densidade óptica a 600 nanômetros.
Diluir a cultura com levedura à base de azoto ou meio YNB até uma densidade óptica final de 0,02. Co-cultura de células de C.neoformans com diferentes concentrações de extratos brutos e clarificados pela mistura de 10 microlitros dos extratos com 190 microlitros da cultura de C.neoformans diluída em uma placa de 96 poços. Meça o crescimento lendo a densidade óptica a 600 nanômetros usando um leitor de placas a cada 15 minutos a uma hora por 72 horas a 200 RPM e 37 graus Celsius.
Os extratos de C.chinensis foram capazes de inibir a atividade proteolítica da subtilisina A, que está relacionada à virulência em Cryptococcus neoformans com valor de IC50 de 5,3 microgramas por mililitro em extratos brutos e 4,53 microgramas por mililitro em extratos clarificados. A avaliação dos extratos de C.chinensis contra processos associados à produção do fator de virulência de C.Neoformans, incluindo o crescimento fúngico, mostrou que houve uma redução significativa no crescimento fúngico a 37 graus Celsius na presença dos extratos brutos e clarificados de C.chinensis. A avaliação dos extratos em relação à cápsula, à produção de melanina e à formação de biofilmes mostrou que não houve alterações na produção de cápsulas ou melanina na presença de extratos brutos ou clarificados de C.chinensis.
No entanto, uma redução significativa de 70 a 80% na formação de biofilme foi observada em altas concentrações dos extratos brutos e clarificados em relação ao controle não tratado. O sucesso do protocolo depende do procedimento de extração adequado, incluindo a moagem, a adição da quantidade apropriada de enzima e apenas a leitura após a adição do substrato. A técnica se concentra na tolerância térmica como um importante fator de virulência criptocócica.
No entanto, outros fatores de virulência podem ser avaliados, como a produção de melanina e cápsulas, bem como a formação de biofilme. Esses resultados abrem novos caminhos que constituem novas abordagens sobre estratégias antifúngicas usando compostos naturais que oferecem mais estabilidade, especificidade e são menos propensos à resistência. O objetivo a longo prazo é encontrar novos métodos contra esses patógenos fúngicos e minimizar os mecanismos de resistência.
