O objetivo geral deste procedimento é usar a microscopia como ferramenta para estudar a fagocitose da espécie fúngica patogênica Cryptococcus neoformans por sua ameba predador ambiental. Este vídeo detalha um protocolo para preparar uma co-cultura de células criptocócicas e amebas que estudarei usando microscopia de varredura a laser confocal e microscopia eletrônica de transmissão. As informações obtidas com o uso dessas técnicas poderiam lançar insights sobre o comportamento das células criptocócicas quando internalizadas durante a infecção.
Tirou as cepas fúngicas de teste em placas de ágar YPD. Incubar a placa por 48 horas a 30 graus Celsius. Raspe um loopful de células da placa de 48 horas de idade e inocula-as em um frasco cônico de 250 mililitros contendo 100 mililitros de caldo YNB que é suplementado com 4% de glicose.
Incubar o frasco a 30 graus Celsius por 24 horas em um agitador rotativo. Após um período de incubação de 24 horas, conte as células fúngicas usando um hemótmetro e ajuste o número celular para um milhão de células por mililitro com solução fisiológica de tampão. Cultivar células de ameba em levedura de peptone extraindo caldo de glicose por uma semana a 30 graus Celsius.
Conte as células de ameba usando um hemótmetro e ajuste o número celular para 10 milhões de células por mililitro com meio ATCC estéril fresco 712. Na sequência, realize um ensaio de viabilidade usando uma mancha azul trypan. É aconselhável trabalhar com células que mostrem pelo menos 80% de viabilidade.
Dispense uma suspensão de 200 microliter de células de ameba padronizadas em câmaras de um slide aderente. Deixe passar duas horas para que as células aderam à superfície a 30 graus Celsius. Enquanto as células de ameba estão se estabelecendo, colorir as células criptocócicas padronizadas com isocitonato de fluoresceína.
Agitar suavemente as células fúngicas por duas horas à temperatura ambiente e no escuro. Dispense a suspensão de 200 microliter de células criptocócicas manchadas após a lavagem em câmaras apropriadas que já contêm células de ameba. Incubar a cocultura preparada a 30 graus Celsius por um período adicional de duas horas.
No final do período de coincubação, lave as câmaras duas vezes com PBS para remover quaisquer células de ameba não ligadas, incluindo células criptocócicas não internalizadas. Aspire o glutaraldeído que foi usado para consertar as células, e lave a câmara duas vezes com PBS. Desmonte o deslizamento da câmara.
Veja as células co-cultivadas usando um microscópio de varredura a laser confocal. Para complementar o ensaio acima, colorir as células criptocócicas com corante pHrodo que permite seletivamente a leitura de células presas dentro do vacuole alimentar. Distribua essas células manchadas nos poços de uma placa de microtiter preta que já contém células de ameba semeadas.
Meça fluorescência em um leitor de microplaca que pode converter sinais logaritômicos em unidades relativas de fluorescência. Adicione cinco mililitros de células criptocócicas padronizadas ao mesmo tubo de centrífuga que já contém cinco mililitros de células de ameba padronizadas. Deixe o tubo ficar por duas horas a 30 graus Celsius.
Aspire o supernatante após centrifugação. Fixar a pelota que representa as células co-cultivadas com um molar de fosfato de sódio tamponado 3%glutaraldeído no pH 7 por três horas. Lave as células co-cultivadas uma vez com tampão fosfato de sódio.
Corrija novamente por 1 1/2 horas em 1%de tetroxida de 1%desmium, seguida de lavagem. Desidratar o material TEM também conhecido como células co-cultivadas em uma série de acetona classificada de 30%50%70%95% e 100% por 15 minutos cada. Aqui, repita a etapa final de desidratação em duas mudanças.
Prepare a resina epóxi pesando a epóxi da consistência normal. Incorpore material na resina epóxi. Polimerizar o material TEM por oito horas a 70 graus Celsius.
Corte seções de 16 nanômetros com facas de vidro montadas no ultratome. Manche as seções com acetato de urano por 10 minutos no escuro seguido de citrato de chumbo por 10 minutos, também no escuro. Veja as seções com um microscópio eletrônico de transmissão.
Para fins ilustrativos, no vídeo, são examinados dois isolados, um que produz ácido graxo 3-hidroxi e o outro que não. 3-hidroxi ácidos graxos são metabólitos secundários que não desempenham papel no crescimento de células criptocócicas. Aqui estão instantâneos que mostram momentos interativos entre Cryptococcus e amebae.
Ao ponto, uma célula criptocócica antes e depois da internalização pode ser observada. Ao estudar fagocitose, o ideal é fazer uso de imagens vivas. No entanto, nem sempre é possível que os pesquisadores tenham acesso a esse microscópio para acompanhar continuamente o processo de fagocitose.
Uma possível solução para compensar essa limitação pode ser complementar imagens com dados quantitativos através da leitura de unidades relativas de fluorescência. O gráfico de barras é um exemplo de dados que usei para complementar as imagens. É importante ressaltar que tanto os dados qualitativos na forma de imagens quanto os dados quantitativos podem ser tomados em diferentes momentos ao longo do tempo.
Ao juntar todas as informações, pode-se começar a construir uma imagem maior do que ocorre durante o processo de fagocitose. A partir dos dados quantitativos, é claro ver que as células com ácidos graxos 3-hidroxi são menos suscetíveis à ação da ameba quando comparadas a células que não produzem ácido graxo 3-hidroxi à medida que menos células são internalizadas. O TEM é particularmente uma ferramenta poderosa, pois pode dar uma visão olho-de-pássaro no lúmen do vacuole alimentar por causa de seu poder de alta resolução, e este é o tipo de detalhe que muitas vezes é perdido ao examinar imagens ao vivo, bem como imagens estáticas.
Neste micrografo TEM específico, protuberâncias na superfície de células criptocócicas podem ser claramente vistas. Anteriormente, foi teorizado que essas estruturas de superfície celular são canais pelos quais os ácidos graxos de 3 hidroxi são liberados no ambiente circundante. Ao ponto, esses canais podem ajudar a fornecer ácidos graxos de 3 hidroxis no lúmen da vacuola alimentar da ameba para alterar as condições internas, daí a promoção da sobrevivência celular.
pHrodo ou como FITC pode ser uma mancha muito melhor para usar, pois ele só fluoresce em um pH baixo, como dentro do vacuole alimentar. Para ser específico, pHrodo só permite ao pesquisador obter dados relativos a células internalizadas. Para isso, é importante que as células sejam suspensas em solução tampão fosfato antes da coloração e que a mídia ameba seja de um pH neutro.
Os operadores de microscópio eletrônico de transmissão devem ser bem treinados para seção adequadamente, pois este é frequentemente o ponto onde os resultados podem ser distorcidos e micrografo danificado por bombardeio de elétrons. Prevê-se que os pesquisadores poderão tirar informações suficientes do protocolo apresentado e otimizá-las em seus próprios estudos. Além disso, os pesquisadores também podem desenvolver anticorpos contra metabólitos e aplicá-los durante seu estudo de microscopia imunofluorescente, incluindo rotulagem de imunogold durante o exame TEM.
