Este método de microscopia de fluorescência quantifica fenótipos de salmonela dentro de células epiteliais intestinais de forma automatizada, permitindo o estudo de salmonela em um grande número de cepas com resolução escalável. Nosso método tem a vantagem de ser quantitativo, de alto rendimento e automatizado ao mesmo tempo, contando com uma análise de área e de célula única. O comportamento intracelular é central para a interação hospedeiro-patógeno de muitas bactérias.
Nosso método pode ser facilmente adaptado a patógenos bacterianos que não a salmonela, contribuindo para a compreensão de sua patogênese. Após a aquisição das imagens, realize a análise de célula única, abrindo a aquisição. czi no ImageJ.
Divida os canais clicando na imagem e selecionando Cor, seguido por Dividir canais. Para segmentação de célula, escolha a imagem do plano Z na janela de título de aquisição C1. Selecione a janela de título de aquisição C1 e clique na imagem seguida da duplicata.
Em seguida, escreva o número do plano Z escolhido. Escreva C1Zplane na caixa de título, desmarque a pilha Duplicada e clique em OK para duplicar somente a imagem do plano Z selecionada. Uma janela chamada C1Zplane mostrando a imagem do plano Z selecionada será aberta.
Agora melhore o contraste da imagem C1Zplane obtida selecionando Processo e clicando em Melhorar contraste. Ajuste os pixels saturados, marque Normalizar e clique em OK para aplicar a técnica de aprimoramento de contraste para obter uma imagem C1Zplane normalizada por contraste. Vá para o Processo e clique em Localizar máximos para segmentar as células epiteliais na imagem C1Zplane normalizada por contraste.
Em seguida, para atribuir apenas um ponto máximo a cada célula epitelial, sinalize a seleção Ponto de visualização e defina a tolerância ao ruído. Para obter a imagem segmentada C1Zplane, uma nova imagem binária semelhante a uma máscara que mostra cada partícula segmentada por ponto máximo marcado, sinalize os máximos de borda Excluir, selecione as partículas segmentadas como Tipo de saída e clique em OK. Em seguida, crie uma máscara de células segmentadas na imagem segmentada C1Zplane. Clique em Analisar, seguido de Analisar Partículas e selecione as opções Mostrar máscaras e Excluir nas bordas.
Defina o intervalo de tamanho e clique em OK para obter a máscara da máscara binária segmentada C1Zplane. Clique na tabela de pesquisa e selecione Inverter tabela de pesquisa na barra de ferramentas. Para limitar a imagem C1Zplane normalizada por contraste, vá para a imagem, selecione Ajustar, selecione Limite e verifique o plano de fundo escuro.
Defina a configuração de limite automático como padrão e escolha a opção vermelha. Ajuste o valor de corte mínimo até que as células apareçam completamente vermelhas, deixando um plano de fundo escuro. Clique em Aplicar para converter a imagem C1Zplane normalizada por contraste em uma imagem binária com células em branco e o plano de fundo em preto.
Além disso, para corrigir a segmentação celular na máscara da máscara binária segmentada C1Zplane, selecione Processo e clique na Calculadora de Imagens. Em seguida, selecione a máscara de C1Zplane segmentada como imagem um, escolha a operação E na lista suspensa e selecione o C1Zplane normalizado por contraste como imagem dois. Clique em OK e ImageJ nomeará automaticamente a imagem de saída como resultados de Máscara de C1Zplane segmentado.
Para rotular cada célula segmentada do C1Zplane como uma região de interesse, clique em Analisar, seguido de Analisar Partículas. Ajuste o tamanho conforme demonstrado anteriormente e selecione a opção Mostrar Nada. Adicione todas as partículas à ferramenta do gerenciador de ROI marcando Adicionar ao gerente.
Além disso, marque Excluir nas bordas e clique em OK. Salve os dados de ROI como roi-cells-acquisitiontitle. percorra o menu do gerenciador de ROI clicando em Mais e selecionando Salvar. Após o término da segmentação celular, trabalhe na janela de título de aquisição de C2 para analisar salmonelas vacuolares.
Primeiro, vá para o Processo, clique na Calculadora de Imagens, selecione o título de aquisição C2 como imagem um e escolha a operação Subtrair na lista suspensa. Em seguida, selecione o título de aquisição C3 como imagem dois, marque Criar nova janela e clique em OK. Aplique a subtração a toda a pilha Z clicando em Sim na janela Pilha de processo. Duplique os resultados da janela de título de aquisição C2 clicando no menu Imagem e selecionando Duplicar.
Em seguida, verifique a pilha duplicada e pressione OK para obter os resultados da aquisição C2 título uma janela. Aplique o desfoque gaussiano aos resultados da aquisição C2 título uma janela indo para o processo, clicando no filtro e selecionando o desfoque gaussiano. Deixe o valor Sigma como dois ou personalize-o.
Clique em OK e aplique o desfoque gaussiano a toda a pilha Z clicando em Sim na janela Pilha de processo. Subtraia os resultados filtrados gaussianos do título de aquisição C2 um para os resultados do título de aquisição C2 clicando em Processo e selecionando a Calculadora de Imagens. Agora selecione os resultados do título de aquisição C2 como imagem um, escolha a operação Subtrair na lista suspensa, selecione os resultados do título de aquisição C2 um como imagem dois e clique em OK. Aplique a subtração a toda a pilha Z clicando em Sim na janela Pilha de processo para obter uma janela automaticamente nomeada pelo ImageJ como os resultados dos resultados do título de aquisição C2.
Para separar as salmonelas do plano de fundo dos resultados dos resultados do título de aquisição de C2, clique na imagem, selecione Ajustar e clique no Limiar. Em seguida, verifique o fundo escuro e defina o limite automático como Otsu. Ajuste o valor de corte mínimo até que as salmonelas apareçam completamente vermelhas, deixando um fundo escuro.
Clique em Aplicar e uma janela chamada Converter para binário será aberta. Verifique o fundo preto e clique em OK. Selecione o plano Z médio correspondente ao plano de foco das salmonelas intracelular nos resultados dos resultados da janela binária do título de aquisição de C2. Clique na imagem seguida de Pilhas e selecione Definir fatia.
Agora escreva o número do plano Z de escolha e clique em OK. Em seguida, defina as medições a serem registradas para cada ROI clicando em Analisar e selecionando Definir medição. Em seguida, verifique a área correspondente à área total de cada ROI. Para registrar a fração de área ocupada por pixels com limite para cada ROI, marque a Fração de Área e o Limite de limite.
Verifique o rótulo Exibir para rotular cada ROI com o título da imagem, o canal, o plano Z e as coordenadas X/Y. Use o plano Z escolhido de salmonelas intracelulares para registrar rótulos, área e porcentagem de área ocupada por salmonelas para cada célula. Abra o roi-cells-acquisitiontitle.
zip clicando no menu Arquivo e selecionando Abrir. Em seguida, clique em Medir no menu ROI Manager. A saída é uma tabela que relata as medidas selecionadas.
Por fim, salve a tabela de resultados selecionando o arquivo e clicando em Salvar como na janela de resultados. A invasão celular, a carga vacuolar e a hiperreplicação citosólica das salmonelas foram visualizadas no interior das células epiteliais. A análise de área revelou uma proporção de infecção significativamente maior em Salmonella typhimurium em comparação com ambas as cepas de Salmonella derby, demonstrando a eficácia da análise de área na detecção de diferenças na capacidade das cepas de salmonela de colonizar células epiteliais.
A cepa mutante excluída por Salmonella derby sipA apresentou uma taxa de hiperreplicação reduzida em comparação com a Salmonella derby do tipo selvagem, consistente com o papel da sipA na indução da hiperreplicação. Não foi observada diferença de hiperreplicação entre Salmonella typhimurium e Salmonella derby do tipo selvagem. A análise unicelular não mostrou diferença significativa na porcentagem de células infectadas em cepas de Salmonella derby em comparação com Salmonella typhimurium.
Caso contrário, as cepas de Salmonella derby geraram uma carga vacuolar média significativamente menor que a de Salmonella typhimurium. Nenhuma diferença foi observada entre Salmonella typhimurium e Salmonella derby do tipo selvagem, enquanto Salmonella derby sipA apresentou uma diminuição significativa na hiper-replicação, consistente com o resultado da análise de área. Salmonella inclui vários sorovares com virulência diversa.
Investigar um grande número de cepas por este método rápido e automatizado contribui significativamente para a compreensão do potencial de virulência real deste patógeno.
