Questo metodo di microscopia a fluorescenza quantifica i fenotipi di salmonella all'interno delle cellule epiteliali intestinali in modo automatizzato, consentendo lo studio della salmonella su un gran numero di ceppi con risoluzione scalabile. Il nostro metodo ha il vantaggio di essere quantitativo, ad alto rendimento e automatizzato allo stesso tempo, basandosi sia su un'analisi ad area che su un'analisi a cella singola. Il comportamento intracellulare è fondamentale per l'interazione ospite-patogeno di molti batteri.
Il nostro metodo può essere facilmente adattato a patogeni batterici diversi dalla salmonella, contribuendo alla comprensione della loro patogenesi. Dopo aver acquisito le immagini, eseguire l'analisi a cella singola aprendo l'acquisizione. czi in ImageJ.
Dividere i canali facendo clic sull'immagine e selezionando Colore, quindi Dividi canali. Per la segmentazione delle celle, scegliete l'immagine del piano Z nella finestra del titolo dell'acquisizione C1. Selezionare la finestra del titolo dell'acquisizione C1 e fare clic sull'immagine seguita dal duplicato.
Quindi, scrivi il numero del piano Z scelto. Scrivere C1Zplane nella casella del titolo, deselezionare Duplica stack e fare clic su OK per duplicare solo l'immagine del piano Z selezionata. Si aprirà una finestra chiamata C1Zplane che mostra l'immagine del piano Z selezionata.
Ora migliora il contrasto dell'immagine dell'immagine C1Zplane ottenuta selezionando Elabora e facendo clic su Migliora contrasto. Regolare i pixel saturi, selezionare Normalizza e fare clic su OK per applicare la tecnica di miglioramento del contrasto e ottenere un'immagine C1Zplane normalizzata per contrasto. Vai al processo e fai clic su Trova massimi per segmentare le cellule epiteliali nell'immagine C1Zplane normalizzata con contrasto.
Quindi, per attribuire un solo punto massimo a ogni cella epiteliale, selezionare la selezione del punto di anteprima e impostare la tolleranza al rumore. Per ottenere l'immagine segmentata C1Zplane, una nuova immagine binaria simile a una maschera che mostra ogni particella segmentata per punto massimo contrassegnato, selezionare Escludi limite massimo, selezionare le particelle segmentate come Tipo di output e fare clic su OK. Quindi, creare una maschera di celle segmentate nell'immagine segmentata C1Zplane. Fate clic su Analizza, quindi su Analizza particelle, quindi selezionate le opzioni Mostra maschere ed Escludi sui bordi.
Impostare l'intervallo di dimensione e fare clic su OK per ottenere la maschera della maschera binaria segmentata C1Zplane. Fare clic sulla tabella di ricerca e selezionare Inverti tabella di ricerca nella barra degli strumenti. Per sospendere l'immagine C1Zplane normalizzata con contrasto, passare all'immagine, selezionare Regola, selezionare Soglia e controllare lo sfondo scuro.
Impostare l'impostazione della soglia automatica su predefinita e scegliere l'opzione rossa. Regolare il valore limite minimo fino a quando le celle appaiono completamente rosse, lasciando uno sfondo scuro. Fare clic su Applica per convertire l'immagine C1Zplane normalizzata per contrasto in un'immagine binaria con celle in bianco e lo sfondo in nero.
Inoltre, per correggere la segmentazione della cella nella maschera della maschera binaria segmentata C1Zplane, selezionare Elabora e fare clic su Image Calculator. Quindi, selezionare la maschera di C1Zplane segmentata come immagine uno, scegliere l'operazione E nell'elenco a discesa e selezionare il C1Zplane normalizzato a contrasto con soglia come immagine due. Fare clic su OK e ImageJ denominerà automaticamente l'immagine di output come risultato di Maschera di C1Zplane segmentato.
Per etichettare ogni singola cella segmentata di C1Zplane come regione di interesse, fare clic su Analizza, quindi su Analizza particelle. Regolare le dimensioni come illustrato in precedenza e selezionare l'opzione Mostra niente. Aggiungi tutte le particelle allo strumento di gestione del ROI selezionando Aggiungi a Manager.
Inoltre, selezionate Escludi sui bordi e fate clic su OK. Salva i dati ROI come roi-cells-acquisitiontitle. Scorri il menu ROI Manager facendo clic su Altro e selezionando Salva. Dopo aver terminato la segmentazione cellulare, lavorare sulla finestra del titolo di acquisizione C2 per analizzare la salmonella vacuolare.
Innanzitutto, vai al Processo, fai clic su Image Calculator, seleziona il titolo dell'acquisizione C2 come immagine uno e scegli l'operazione Subtract nell'elenco a discesa. Quindi, selezionare il titolo dell'acquisizione C3 come immagine due, selezionare Crea nuova finestra e fare clic su OK. Applicare la sottrazione all'intero stack Z facendo clic su Sì nella finestra Stack di processi. Duplicare i risultati della finestra del titolo dell'acquisizione C2 facendo clic sul menu Immagine e selezionando Duplica.
Quindi controllare lo stack duplicato e premere OK per ottenere i risultati del titolo di acquisizione C2 in una finestra. Applicare la sfocatura gaussiana ai risultati di una finestra del titolo di acquisizione C2 accedendo a Processo, facendo clic sul filtro e selezionando la sfocatura gaussiana. Lasciare il valore Sigma come due o personalizzarlo.
Fare clic su OK e applicare la sfocatura gaussiana all'intero stack Z facendo clic su Sì nella finestra Elabora stack. Sottrarre i risultati filtrati gaussiani del titolo di acquisizione C2 uno ai risultati del titolo di acquisizione C2 facendo clic su Elabora e selezionando il calcolatore di immagini. Ora seleziona i risultati del titolo dell'acquisizione C2 come immagine uno, scegli l'operazione Sottrai nell'elenco a discesa, seleziona i risultati del titolo di acquisizione C2 uno come immagine due e fai clic su OK. Applicare la sottrazione all'intero stack Z facendo clic su Sì nella finestra Stack di processi per ottenere una finestra denominata automaticamente da ImageJ come risultato dei risultati del titolo di acquisizione C2.
Per separare le salmonelle dallo sfondo dei risultati dei risultati del titolo di acquisizione C2, fare clic sull'immagine, selezionare Regola e fare clic sulla soglia. Quindi, controlla lo sfondo scuro e imposta la soglia automatica su Otsu. Regolare il valore minimo di taglio fino a quando le salmonelle appaiono completamente rosse, lasciando uno sfondo scuro.
Fare clic su Applica e si aprirà una finestra denominata Converti in binario. Controlla lo sfondo nero e fai clic su OK. Selezionare il piano Z medio corrispondente al piano di messa a fuoco intracellulare delle salmonelle nei risultati della finestra binaria del titolo di acquisizione C2. Fare clic sull'immagine seguita da Pile e quindi selezionare Imposta sezione.
Ora scrivi il numero del piano Z scelto e fai clic su OK. Quindi, impostare le misurazioni da registrare per ogni ROI facendo clic su Analizza e selezionando Imposta misurazione. Quindi, controlla l'area corrispondente all'area totale di ciascun ROI. Per registrare la frazione di area occupata da pixel con soglia per ogni ROI, controlla Frazione di area e Limita alla soglia.
Controlla l'etichetta Display per etichettare ogni singolo ROI con il titolo dell'immagine, il canale, il piano Z e le coordinate X/Y. Utilizzare il piano Z scelto delle salmonelle intracellulari per registrare le etichette, l'area e l'area percentuale occupata dalle salmonelle per ogni singola cellula. Aprire roi-cells-acquisitiontitle.
comprimere facendo clic sul menu File e selezionando Apri. Quindi, fai clic su Misura nel menu ROI Manager. L'output è una tabella che riporta le misurazioni selezionate.
Infine, salvare la tabella dei risultati selezionando il file e facendo clic su Salva con nome nella finestra dei risultati. L'invasione cellulare, il carico vacuolare e l'iperreplicazione citosolica della salmonella sono stati visualizzati all'interno delle cellule epiteliali. L'analisi dell'area ha rivelato un rapporto di infezione significativamente più elevato in Salmonella typhimurium rispetto a entrambi i ceppi di Salmonella derby, dimostrando l'efficacia dell'analisi dell'area nel rilevare differenze nella capacità dei ceppi di salmonella di colonizzare le cellule epiteliali.
Il ceppo mutante sipA-deleted di Salmonella derby ha mostrato un rapporto di iper-replicazione ridotto rispetto al Salmonella derby wild-type, coerente con il ruolo del sipA nell'indurre l'iper-replicazione. Non è stata osservata alcuna differenza di iperreplicazione tra Salmonella typhimurium e Salmonella derby wild-type. L'analisi a singola cellula non ha mostrato differenze significative nella percentuale di cellule infette nei ceppi di Salmonella derby rispetto a Salmonella typhimurium.
In caso contrario, i ceppi di Salmonella derby hanno generato un carico vacuolare medio significativamente inferiore a quello di Salmonella typhimurium. Non è stata osservata alcuna differenza tra Salmonella typhimurium e Salmonella derby wild-type, mentre Salmonella derby sipA ha mostrato una significativa diminuzione dell'iperreplicazione, coerente con il risultato dell'analisi dell'area. La salmonella comprende diversi sierotipi con diversa virulenza.
Lo studio di un gran numero di ceppi con questo metodo rapido e automatizzato contribuisce in modo significativo alla comprensione del reale potenziale di virulenza di questo patogeno.
