Usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra

Este método pode ajudar a detectar a toxicidade óssea induzida por produtos químicos no peixe-zebra. A coloração vermelha de alizarina do tecido fixo gera um registro permanente de alterações esqueléticas que podem facilitar comparações de vários espécimes. Esta técnica pode ser útil para estudar a osteoporose no modelo do peixe-zebra, uma vez que uma das características da osteoporose é a diminuição da massa óssea.

Remova 10 larvas de peixe-zebra aleatoriamente de cada grupo aos nove dias após a fertilização e fixe o peixe em um mililitro de aldeído paraforme a 2% e 1X PBS por duas horas. Decantar a solução e lavar a larva de peixe-zebra utilizando 100 milimolares Tris HCL com um pH de 7,5 ou 10 milimolares de cloreto de magnésio. Para descoloração, decantar a solução e incubar a larva por cinco minutos em uma série de soluções, conforme descrito no manuscrito.

Após a incubação final, decantar a solução e remover o pigmento por branqueamento com uma solução constituída por peróxido de hidrogénio a 3% e hidróxido de potássio a 0,5%. Observe uma vez a cada 10 minutos até que o pigmento seja completamente removido. Lave a larva do peixe-zebra várias vezes com 25% de glicerina, hidróxido de potássio a 0,1% por 10 minutos cada até que não haja bolhas.

Manchar a larva por imersão em um mililitro de 0,01% Alizarina. Decante a solução e adicione um mililitro de 50% de glicerina ou hidróxido de potássio a 0,1% para limpar o fundo. Conservar o peixe em 50% de glicerina fresca ou hidróxido de potássio a 0,1% para observação subsequente.

Transfira uma larva de cada vez para a lâmina de vidro mantendo a larva no meio da gota líquida. Observe a larva sob um microscópio estéreo. Ligue a câmera.

Abra o software e mantenha as configurações padrão. Clique em AE e escolha um tempo de exposição adequado para obter a melhor imagem. Capture todas as imagens nas mesmas configurações.

Salve as imagens no formato dot tiff para análise posterior. Clique duas vezes no ícone imageJ. Para analisar as imagens salvas, clique em arquivo, em seguida, abra, em seguida, clique em imagem, em seguida, digite e selecione oito bits.

Clique em editar e inverta. Clique em analisar e, em seguida, calibre. Selecione OD não calibrado na interface pop-up.

Verifique a calibração global no canto inferior esquerdo da interface inferior e clique em OK. Clique em analisar, defina a escala e, em seguida, remova a escala. Confira global abaixo, e clique em OK.

Clique em analisar e, em seguida, defina as medições. Selecione a área do item na interface pop-up. Verifique o limite para o limite abaixo para medir apenas o intervalo selecionado e clique em OK.

Clique na imagem, ajuste, depois limite e deslize o controle deslizante no meio da interface pop-up. Para selecionar o limite apropriado para que todos os destinos a serem testados em uma imagem sejam selecionados. E clique em definir.

Clique em analisar, em seguida, medir, salvar as datas. A coloração vermelha de alizarina é um método sensível e específico para medir mudanças na mineralização óssea em larvas de peixe-zebra. Aos nove dias após a fertilização, muitos ossos do esqueleto da cabeça, como parasfenóide, opercular, ceratobranquial e notocordina são mineralizados e, portanto, corados de vermelho.

Em contraste, estruturas não ósseas, como otólitos, parecem pretas marrons. A análise digital realizada para quantificar a área total corada, mostrou uma diminuição significativa na área corada para os grupos de tratamento com acetato de chumbo de 10 e 20 miligramas por litro. As alterações na mineralização óssea mostraram dependência da dose.

Para um melhor efeito de coloração e observação, é importante remover o pigmento original das larvas de peixe-zebra e remover as bolhas após o branqueamento.