Este protocolo é significativo porque permite a derrubada e a expressão excessiva de genes em um peixe em desenvolvimento, e a quantitação desses efeitos a jusante sobre as células sanguíneas. Este protocolo é rápido, fácil de executar, econômico e fácil de automatizar com acesso à instrumentação adequada. Demonstrando esse procedimento será Kristen Rueb, pesquisadora de graduação em laboratório.
Comece transferindo entre cinco e 200, 48 horas post fertilização embriões em uma placa de Petri de plástico de 10 centímetros. Incline o prato para que o embrião afunde até a borda inferior, e remova o máximo de E3 médio do prato possível. Em seguida, adicione 500 microliters de protease de descorionação aos embriões.
Depois de cinco minutos em temperatura ambiente, coloque todos os embriões na borda inferior da placa novamente e bata suavemente na lateral do prato, permitindo que os embriões esfreguem suavemente contra a parte inferior da placa para remover completamente seus acordes. Usando uma garrafa de aperto adicione aproximadamente 20 mililitros de meio E3 para diluir a protease, e permitir que os embriões se instalem. Em seguida, decantar o meio, e enxaguar os embriões mais três vezes com meio fresco como apenas demonstrado para remover todos os traços da protease.
Para preparar os embriões para dissociação, use uma pipeta P1000 para transferir cinco a dez embriões em um, tubo micro centrífuga de 1,5 mililitro e aspirar o meio E3 transferido. Em seguida, adicione um mililitro de 10 mililitros DTT em E3 médio ao zebrafish embrionário, e coloque o tubo de microcentrifuge em uma posição horizontal por 30 minutos à temperatura ambiente para remover o revestimento do muco. Para dissociação de embriões, lave os embriões tratados DTT três vezes com um mililitro de DPBS suplementado com cálcio e magnésio por lavagem.
Antes de adicionar 500 microliters de DPBS suplementados com cálcio e magnésio, e cinco microlitres de cinco miligramas por mililitro, protease dissociação. Em seguida, incubar as amostras a 37 graus Celsius em um agitador orbital horizontal a 185 rotações por minuto durante 60 minutos. Certifique-se de verificar periodicamente os embriões, para que você não os digera demais.
Quando uma amostra não completamente homogênea com algum tecido sólido presente pode ser observada, triturar os embriões com uma pipeta P1000 até que a amostra esteja totalmente dissociada. Para preparar as células embrionárias de zebrafish dissociadas para citometria de fluxo, transfira toda a amostra celular para o reservatório superior de um tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros, com uma tampa de coador celular de 35 micrômetros. Enxágüe a tampa com quatro mililitros de PBS sem cálcio ou magnésio, e pelota as células por centrifugação.
Em seguida, resuspend as células em 500 microliters de PBS sem cálcio e magnésio por tubo. Para análise citométrica de fluxo das células embrionárias do zebrafish, o vórtice suavemente as suspensões celulares antes de adicionar uma diluição de uma a mil manchas de células mortas vermelhas a cada tubo. Dentro de 30 minutos após a aplicação da mancha de célula morta, esvazie o tanque de resíduos, encha o tanque de baia com a solução apropriada e inicie o sistema fluido do citómetro de fluxo.
No software de análise, desenhe cinco parcelas e defina o primeiro plot para medir a dispersão para frente versus lateral. Coloque a dispersão para a frente como linear, e a dispersão lateral para logarítmica. Defina o segundo plot para medir a altura de dispersão dianteira versus a largura de dispersão para a frente, e o terceiro gráfico para medir a altura de dispersão versus largura de dispersão lateral.
Defina o quarto plano para medir a mancha de célula morta vermelha no eixo x, e disperso lateral no eixo y para permitir a discriminação de células mortas. O quinto enredo deve ser definido para medir o fluorohore de escolha. Quando todas as parcelas tiverem sido definidas, carregue a amostra no citômetro e reduza a taxa de fluxo para que as células não se escorram rapidamente.
Ajuste as configurações de dispersão dianteira e lateral para que a maior parte da população celular possa ser claramente observada, e desenhe um portão em torno da população celular. Rotule essas celas. Com o segundo gráfico de pontos fechado nas celas, o portão na dispersão dianteira e os singlets de dispersão lateral para excluir doublets.
Na quarta parcela, ajuste as configurações da mancha de células mortas vermelhas para que haja uma população claramente negativa. Desenhe um portão ao redor dessas celas e rotule essas celas vivas do portão. No quinto lote, portão nas células vivas e desenhar um portão ao redor das células positivas, em seguida, executar cada amostra coletando pelo menos 25.000 eventos de células ao vivo.
Quando todas as amostras tiverem sido analisadas, siga o procedimento de desligamento para desligar os fluidos, reabastecer o tanque de baia e esvaziar o tanque de resíduos. Após analisar a porcentagem de glóbulos vermelhos positivos de GFP de cada amostra de zebrafish embrionário, a média de todo o grupo controle pode ser calculada. Normalmente, a média é definida como um e todos os percentuais são calculados a partir deste ponto de referência.
Nesta análise representativa, foi determinado que a redução da transcrição do ISM1 com um morfolino específico, reduza o número de glóbulos vermelhos positivos GFP presentes dentro de 48 horas após os embriões de fertilização. Resgatando essa redução nos níveis de morfolino ISM1 com mRNA exógeno, devolva o número de glóbulos vermelhos ao normal. A digestão adequada nas amostras é crítica.
Se você digerir demais ou subestimar, você não terá os resultados corretos. Se uma máquina de fax estiver disponível, os pesquisadores podem coletar as células sanguíneas classificando-se para cultura in vitro, sequenciamento de RNA e RT-PCR quantitativo.
