Os métodos e modalidades de imagem utilizados neste protocolo constituem uma excelente imagem da segurança e eficácia da terapia gênica no coração isquêmico antes de se proceder aos ensaios clínicos. As principais vantagens dessa técnica são a baixa invasividade do modelo de isquemia, mas também o direcionamento preciso da terapia gênica para áreas hipocinéticas, mas ainda viáveis do coração. Comece realizando o ecocardiograma transtorácico antes da operação de isquemia, transferência de genes e eutanásia para avaliar qualquer líquido pericárdico detectável e determinar o estiramento miocárdico.
Colocar o transdutor no terceiro ou quarto espaço intercostal sob a axila do porco com um marcador apontando para o esterno do porco para acessar as incidências paraesternais do eixo curto ao nível da valva mitral, músculo papilar e níveis apicais. Em seguida, pressione adquirir para salvar um clipe. Para a realização da cineangiocoronariografia diretamente antes da operação de isquemia, utilizar cateter 6-F sob orientação fluoroscópica com contraste iodado para obtenção de imagens da artéria coronária direita, da artéria coronária ascendente esquerda e da artéria descendente anterior.
Para cine imaging no autoinjetor, defina a duração do bolus em três segundos e o volume total para 21 mililitros e, em seguida, pressione single, e sim para administrar o agente de contraste iodado no ventrículo esquerdo através de um cateter pigtail 5-F. Realizar cine imaging do animal em repouso e, em seguida, administrar dobutamina por via intravenosa e doses crescentes para a indução de estresse. Uma vez atingida a frequência cardíaca alvo de 160 batimentos por minuto, realiza cine imaging e remove o cateter pigtail.
Para calcular a fração de ejeção abra o software de medição, selecione a análise ventricular da imagem em questão. Role a imagem para selecionar um período de tempo, um em diástole e outro em sístole e, em seguida, selecione uma ferramenta para desenhar contornos ventriculares de cada período de tempo. Para induzir a isquemia miocárdica crônica, 14 dias antes da transferência gênica, colocar uma bobina na artéria coronária esquerda, deslizar o stent de gargalo para a artéria coronária esquerda e colocar o stent distalmente à primeira diagonal.
Inflar o stent à pressão nominal na artéria, utilizando um indeflator com relação stent/lúmen de 1,3 para ancoragem do gargalo. Após mais 15 segundos, esvaziar o stent, retrair o equipamento da artéria e garantir a colocação correta de um stent de gargalo por angiografia. Após angiografia e medidas funcionais sob orientação fluoroscópica, introduzir um cateter de mapeamento para o ventrículo esquerdo através da bainha femoral para mapeamento eletroanatômico, coletar pelo menos 100 pontos do ventrículo esquerdo e clicar em aceitar para aprovar um ponto.
No mapa final, para viabilidade, use uma tensão unipolar acima de cinco milivolts como critério. E para hipocinesia, selecione um encurtamento linear local o mais baixo possível, pelo menos tão baixo quanto 12%, mas de preferência abaixo de 6% Após a eutanásia do animal, retire o coração da cavidade torácica. Uma vez que o coração colhido é enxaguado, coloque uma agulha de calibre 18 acima da válvula aórtica e conecte a agulha a uma bomba de perfusão.
Perfundir o coração com 750 mililitros de paraformaldeído a 1%. Use uma faca afiada para cortar o coração em fatias de um centímetro de espessura e colete as amostras da área de transferência de genes em paraformaldeído a 4% e nitrogênio líquido. Armazenar as amostras para coloração em paraformaldeído a 4% durante 48 horas a quatro graus Celsius.
A eficácia da terapia gênica foi analisada medindo-se o estiramento circunferencial, a fração de ejeção e a perfusão miocárdica por PET scan de 15O-água. As amostras de tecido podem ser coletadas diretamente da área de transferência gênica, comparando-se o coração com o mapa eletroanatômico. A expressão transgênica e a angiogênese terapêutica foram avaliadas por meio de análise imuno-histológica, analisando o número de células positivas após a coloração com Beta-galactosidase, e pela análise da área capilar miocárdica, após a coloração da molécula 1 de adesão plaquetária/célula endotelial.
É importante confirmar a colocação do stent de gargalo por meio de angiografia e coleta de amostra da área de transferência gênica, o que pode ser confirmado comparando-se o coração com o mapa eletroanatômico. No geral, é crucial fazer todas as medições da maneira mais reprodutível.
