Die Methoden und Bildgebungsmodalitäten, die in diesem Protokoll verwendet werden, stellen ein hervorragendes Bild der Sicherheit und Wirksamkeit der Gentherapie beim ischämischen Herzen dar, bevor mit klinischen Studien begonnen wird. Die Hauptvorteile dieser Technik liegen in der geringen Invasivität des Ischämiemodells, aber auch in der präzisen Ausrichtung der Gentherapie auf hypokinetische und dennoch lebensfähige Bereiche des Herzens. Beginnen Sie mit der Durchführung der transthorakalen Echokardiographie vor der Ischämieoperation, dem Gentransfer und der Euthanasie, um jede nachweisbare Perikardflüssigkeit zu beurteilen und die Myokardbelastung zu bestimmen.
Platzieren Sie den Schallkopf im dritten oder vierten Zwischenrippenraum unter der Achselhöhle des Schweins mit einer Markierung, die auf das Brustbein des Schweins zeigt, um auf parasternale Kurzachsenansichten auf Mitralklappenebene, Papillarmuskel und apikaler Ebene zuzugreifen. Drücken Sie dann auf Erfassen, um einen Clip zu speichern. Für die Durchführung der Koronarangiografie unmittelbar vor der Ischämieoperation wird ein 6-F-Katheter unter Durchleuchtungskontrolle mit einem Jodkontrastmittel verwendet, um die rechte Koronararterie, die linke aufsteigende Koronararterie und die linke vordere absteigende Arterie darzustellen.
Stellen Sie für die Cine-Bildgebung im Autoinjektor die Bolusdauer auf drei Sekunden und das Gesamtvolumen auf 21 Milliliter ein und drücken Sie dann Single und Ja, um Jodkontrastmittel über einen 5-F-Pigtail-Katheter in den linken Ventrikel zu verabreichen. Führen Sie eine Filmbildgebung des ruhenden Tieres durch und verabreichen Sie dann Dobutamin intravenös und in eskalierenden Dosen zur Stressinduktion. Sobald die Zielherzfrequenz von 160 Schlägen pro Minute erreicht ist, führt die Cine-Bildgebung durch und entfernt den Pigtail-Katheter.
Um die Ejektionsfraktion zu berechnen, öffnen Sie die Messsoftware und wählen Sie die ventrikuläre Analyse des betreffenden Bildes. Scrollen Sie durch das Bild, um einen Zeitrahmen auszuwählen, einen in der Diastole und einen in der Systole, und wählen Sie dann ein Werkzeug aus, um ventrikuläre Umrisse jedes Zeitrahmens zu zeichnen. Um die chronische Myokardischämie zu induzieren, platzieren Sie 14 Tage vor dem Gentransfer eine Spule in der linken Koronararterie, gleiten Sie den Engpass-Stent in die linke Koronararterie und platzieren Sie den Stent distal zur ersten Diagonalen.
Pumpen Sie den Stent auf den Nenndruck in der Arterie auf, indem Sie einen Indeflator mit einem Stent-Lumen-Verhältnis von 1,3 verwenden, um den Flaschenhals an Ort und Stelle zu verankern. Nach weiteren 15 Sekunden entleeren Sie den Stent, ziehen Sie das Gerät aus der Arterie zurück und stellen Sie die korrekte Platzierung eines Engpass-Stents durch Angiographie sicher. Nach der Angiographie und den funktionellen Messungen unter Durchleuchtungskontrolle wird ein Kartierungskatheter über die Femurschleuse zur elektroanatomischen Kartierung in den linken Ventrikel eingeführt, mindestens 100 Punkte aus dem linken Ventrikel entnommen und auf Akzeptieren geklickt, um einen Punkt zu genehmigen.
Verwenden Sie in der endgültigen Karte für die Durchführbarkeit eine unipolare Spannung über fünf Millivolt als Kriterium. Und bei Hypokinesie wählen Sie eine lokale lineare Verkürzung, die so niedrig wie möglich ist, mindestens so niedrig wie 12 %, vorzugsweise aber unter 6 %Nach dem Einschläfern des Tieres das Herz aus der Brusthöhle entnehmen. Sobald das entnommene Herz gespült ist, platzieren Sie eine 18-Gauge-Nadel über der Aortenklappe und befestigen Sie die Nadel an einer Perfusionspumpe.
Das Herz mit 750 Millilitern 1%Paraformaldehyd durchbluten. Verwenden Sie ein scharfes Messer, um das Herz in ein Zentimeter dicke Scheiben zu schneiden, und sammeln Sie die Proben aus dem Gentransferbereich in 4%Paraformaldehyd und flüssigen Stickstoff. Lagern Sie die Proben zur Färbung in 4%igem Paraformaldehyd für 48 Stunden bei vier Grad Celsius.
Die Wirksamkeit der Gentherapie wurde durch Messung der Umfangsdehnung, der Ejektionsfraktion und der myokardialen Perfusion mittels 15O-Wasser-PET-Scan analysiert. Die Gewebeproben können direkt aus dem Gentransferbereich entnommen werden, indem das Herz mit der elektroanatomischen Karte verglichen wird. Die Transgenexpression und die therapeutische Angiogenese wurden durch immunhistologische Analysen durch Analyse der Anzahl positiver Zellen nach Beta-Galactosidase-Färbung und durch Analyse des myokardialen Kapillarbereichs nach Thrombozyten-/Endothelzelladhäsionsmolekül-1-Färbung bewertet.
Es ist wichtig, die Platzierung des Engpass-Stents mittels Angiogramm und Probenentnahme aus dem Gentransferbereich zu bestätigen, was durch einen Vergleich des Herzens mit der elektroanatomischen Karte bestätigt werden konnte. Insgesamt ist es entscheidend, alle Messungen so reproduzierbar wie möglich durchzuführen.
