Este protocolo de isolamento de hepatócitos de rato é baseado na ressecção hepática antes da abordagem de digestão. O protocolo introduz um sistema de perfusão integrado compacto e portátil para isolamento celular. Esta técnica envolve a recirculação de colagemnase que reduz o volume de uso de colagemnase, e proporciona mais flexibilidade na extensão do tempo de digestão, garantindo alto rendimento de gravidade e função específica de hepatócitos.
Coloque o rato no capô. Depois de cortar os músculos abdominais, empurre os intestinos para a direita com a parte de trás dos fórceps curvos. Quebre a membrana sob o ducto biliar com a ponta das fórceps curvas para enrolar a sutura ao redor da veia do portal e do ducto biliar.
Use uma sutura cirúrgica de seda para fazer uma ligadura muito solta ao redor da veia portal perto do fígado, pouco antes dos ramos da veia esquerda e direita em diferentes lóbulos do fígado. Cerca de dois a três centímetros a montante da primeira ligadura, pouco antes da veia gástrica se ramificar da veia portal, criar um buraco através do tecido sob a veia do portal com as pontas de dois pares de fórceps curvados. Em seguida, estique o orifício para apoiar a veia do portal durante a cannulação.
Evite o acúmulo de pressão no fígado reduzindo a velocidade da bomba para quatro RPM para uma taxa de fluxo de aproximadamente três mililitros por minuto. E certifique-se de que o fluxo do tampão livre de cálcio do cateter intravenoso seja reduzido a um gotejamento lento. Enquanto apoia suavemente a veia portal com fórceps, segure o cateter intravenoso com o bisbilhoteiro da agulha virado para cima.
E insira a agulha na veia portal em um ângulo de 10 a 20 graus. Em seguida, avance lentamente até que todo o bisel esteja dentro da veia. A inserção correta deve resultar em branqueamento da cor hepática.
Avance a cânula sobre a agulha, e retraia a agulha atrás da cânula puxando para trás a asa com o dedo indicador enquanto segura o cateter com o polegar e o dedo médio. Fixar a veia do portal no cateter com um grampo de veia e clipe abaixo da veia do portal para evitar interrupções de fluxo perfusante. Em seguida, corte a veia cava inferior infrahóptica para evitar o acúmulo de pressão no fígado, e observe impulsos de esguicho sanguíneo para garantir o corte correto.
Aumente a velocidade da bomba para 38 RPM para uma vazão de aproximadamente 33 mililitros por minuto. E lave o fígado três vezes fechando a veia cava inferior infraháptica com fórceps por dois a três segundos, e depois reabrindo-o. A fim de perfundir todos os lóbulos do fígado, ajuste a posição da ponta da cânula e certifique-se de que ela seja colocada antes que a veia do portal se espeúda em diferentes lóbulos do fígado.
Em seguida, aperte a ligadura solta ao redor da veia portal, ligeiramente a montante do ponto de ramificação, e fixe a posição da cânula na veia portal para evitar o backflow do buffer fazendo três nós no ponto onde a agulha dura suporta a cânula, entre o chanfrado e o orifício lateral. Após a ressecção hepática, permita que o fígado peruse com o tampão livre de cálcio por 12 minutos. Em seguida, aperte o grampo do tampão livre de cálcio e solte o grampo do rolo do tampão de colagem para alterar o tampão de perfusão.
Depois que o tampão de colagem chega ao fígado, lave o fígado três vezes fechando a veia cava inferior suprahepática por dois a três segundos e reabrindo-o. Mova cuidadosamente o fígado para o palco em cima do béquer para recirculação do tampão de colagenase segurando o diafragma com fórceps enquanto apoia o cateter, tomando cuidado para não puxar o cateter para evitar o descolamento acidental. Digerir o fígado por 12 minutos, e parar a perfusão quando o fígado perde sua textura marrom lisa e fica mole.
Estenda o tempo de digestão, se necessário. Após a digestão do fígado cortar a veia portal cuidadosamente remover a cânula. E então transfira o fígado para dMEM frio para isolar os hepatócitos.
Bata suavemente o fígado usando a parte de trás das fórceps curvas para quebrar e descascar a cápsula de brilho. E libere as células hepáticas balançando suavemente o fígado no DMEM até que as células estejam totalmente dissociadas na mídia. A viabilidade dos hepatócitos foi entre 88 a 94,8%, conforme determinado pela viagem e pela contagem azul.
O rendimento de hepatócitos de ratos pesando de 200 a 300 gramas foi de até cinco vezes 10 para as oitavas células por isolamento. As imagens representativas mostram suspensão não purificada de células hepáticas e suspensão de hepatocitado purificada. A pureza dos hepatócitos isolados foi de aproximadamente 96,8%, quantificada pela contagem de albuminas positivas fluorescentes em relação ao número total dos núcleos celulares.
Nas imagens representativas mostradas em cores falsas, o verde representa a albumina, e o azul indica os núcleos celulares com albumina. Núcleos celulares sem albumina são destacados em vermelho. Os hepatócitos na cultura sanduíche formaram canais biliais distintos, e tiveram um bom contato celular.
Como mostrado pelos ensaios albumina, ureia e citocromo P450, os hepatócitos exibiam alta ureia e secreção de albumina. No terceiro dia, os hepatócitos apresentaram altas atividades enzimáticas para CYP1A2, CYP2B1/2 e CYP3B2. Esteja preparado mentalmente antes de inserir a agulha na veia do portal.
Após a inserção, um cirurgião precisará continuar sem pulso até que a velocidade da bomba seja aumentada após o corte do IVC.
