Microbiologistas e médicos de doenças infecciosas estão começando a perceber a importância das infecções associadas ao biofilme em doenças crônicas. O NIH chegou a dizer que mais de 80% das infecções crônicas são devido a biofilmes bacterianos. Isso tem insistido na ênfase no enfrentamento do biofilme e no desenvolvimento de terapêuticas que abordam o problema do biofilme.
E muitos desses terapêuticos estão focados na dispersão de células bacterianas que estão em biofilmes fora do biofilme para que possam ser mais facilmente mortas. Mas realmente não há muitos protocolos na literatura atualmente que abordam como determinar a eficácia de tal agente disperso. Então achamos que este é um bom protocolo para usar.
É um tipo de infecção bacteriana que está associada ao biofilme. E também achamos que pode ser otimizado facilmente para estudar muitos tipos diferentes de espécies bacterianas, e como eles formam biofilmes e dispersão, bem como diferentes agentes dispersos. E achamos importante entregar isso em um formato de vídeo, pois vimos que existem nuances especialmente para a entrega do agente que encontramos funcionando de forma ideal em ratos.
Para começar, avalie o plano da anestesia por beliscão do dedo do dedo do sol, e monitorando a taxa respiratória e o esforço. Raspe a superfície dorsal e aplique um creme depilatório na região raspada por 10 minutos, ou de acordo com as instruções do produto. Retire delicadamente o creme depilatório.
E certifique-se de que a pele está seca. Usando um marcador à prova de álcool, desenhe um círculo com um diâmetro de 1,5 centímetros em direção à região posterior da parte traseira. Para o tratamento da dor, administre 0,05 mililitros de lidocaína subcutânea na área a ser extirpada.
E 0,02 mililitros de buprenorfina subcutânea no pescoço. Aguarde 10 minutos para garantir que o tratamento da dor seja alcançado. Antes da excisão, desinfete a superfície dorsal usando um cotonete de álcool.
Mantenha um campo cirúrgico estéril durante todo o procedimento e use instrumentos autoclavados e luvas estéreis para limitar a contaminação. Administre uma ferida excisional de espessura completa ao nível do músculo panniculus, com uma tesoura cirúrgica. Após a excisão, cubra imediatamente a ferida com um curativo de poliuretano semipermeável.
Separe cuidadosamente o apoio do curativo usando dois fórceps finos, se aplicável. Injete aproximadamente 10 para a quarta UFC de bactérias, e 100 microliters PBS sob o curativo e no leito da ferida para estabelecer uma infecção. Note que as feridas também podem ser infectadas com várias espécies de bactérias e/ou fungos simultaneamente, ou colocando biofilmes pré-formados ou mesmo tecido de desbridamento extraído de pacientes no leito da ferida.
Após a infecção, coloque os ratos em gaiolas em cima de toalhas de papel para evitar que os ratos asfixiem no material de cama. Coloque as gaiolas em almofadas de aquecimento e monitore os ratos até que eles recuperem seu reflexo de direita. Remova a toalha de papel neste momento.
Permita que infecções de feridas se estabeleçam por 48 horas. Inspecione o curativo diariamente para obter lágrimas em áreas de não adesão e substitua-o se necessário. Coloque os camundongos sob anestesia isoflurane a 3% e um litro por minuto de oxigênio, enquanto administra os tratamentos.
Injete 200 microliters de solução enzimática ou controle de PBS sobre a ferida, levantando a pele ligeiramente anterior da ferida com fórceps, perfurando cuidadosamente a pele levantada com a seringa, e injetando lentamente a solução na área entre o leito da ferida e o curativo. Para garantir que toda a cama da ferida esteja coberta por solução, levante suavemente o curativo com fórceps, afastando-o lentamente da cama da ferida, enquanto injeta lentamente a solução. Após o tratamento, coloque os ratos de volta em gaiolas por 30 minutos.
Após 30 minutos de exposição ao tratamento, reanesthetize os camundongos com isoflurane e aspire a solução restante com uma seringa, perfurando na mesma área de antes. Note que esta solução aspirada contém células bacterianas dispersas, que podem ser salvas para várias análises a jusante. Administrar o segundo e terceiro tratamentos de irrigação, como foi feito para o primeiro usando uma nova seringa cada vez.
Se uma cepa luminescente de bactérias for utilizada para iniciar a infecção, um sistema de imagem in vivo pode ser usado para visualizar a dispersão do leito da ferida. Para análise, abra as imagens no software IVIS e selecione a área a ser analisada com a paleta de ferramentas. Para explicar o fundo, coloque um círculo no fundo de uma imagem e, em seguida, coloque o mesmo círculo de tamanho em cima da cama de ferida para cada rato.
Na paleta de ferramentas, selecione Medir ROIs e carregue a tabela de medições em uma planilha. Subtraia a leitura do círculo de fundo de cada uma das medidas do leito da ferida para calcular a luminescência de cada amostra. Após a eutanásia humana, colhia o tecido do leito da ferida removendo primeiro suavemente o curativo com fórceps estéreis, e cortando ao redor do perímetro do leito da ferida com uma tesoura cirúrgica estéril.
Use fórceps para levantar suavemente uma extremidade do leito da ferida e, em seguida, use uma tesoura para cortar a amostra de tecido longe da camada muscular. Coloque a amostra de tecido em um tubo de homogeneização pré-pesado de dois mililitros contendo um mililitro de PBS. Pesar novamente o tubo depois de inserir a amostra.
Para colher o baço, coloque o rato em uma posição anatômica supina e fixe fixando as extremidades em uma superfície de dissecção. Mergulhe a área a ser dissecada com 70% de etanol para ajudar a evitar a contaminação. Faça uma pequena incisão perpendicular à linha média com uma tesoura cirúrgica na dermes do abdômen inferior.
Certifique-se de puxar a pele para cima e para longe dos órgãos internos. Continue a incisão ao longo da linha média até que o esterno seja atingido. Uma vez que a cavidade peritoneal é exposta e os órgãos internos são visíveis, separe o baço do tecido conjuntivo e coloque em um tubo de homogeneização pré-pesado separado.
Pesar novamente o tubo depois de inserir o baço. Homogeneize as amostras a cinco metros por segundo, durante 60 segundos, duas vezes. Para enumerar a UFC, diluir e detectar em série as amostras homogeneizadas.
Diluído em série por pipetar 100 microliters da amostra homogeneizada em 900 microliters de PBS e um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Vórtice antes de continuar a diluição, pipetando 100 microliters da amostra diluída em um tubo separado contendo 900 microliters de PBS. Repita estas etapas até que seis diluições sejam alcançadas.
Pipeta 10 microliters de cada diluição na área indicada em uma placa de ágar, como mostrado. Se for necessária uma quantitação mais precisa da UFC, espalhe 100 microlitres de cada diluição da amostra através de placas de ágar separadas. Ferir e infectar camundongos com aproximadamente 10 a 4ª UFC de bactérias, conforme descrito no protocolo in vivo.
Permita que a infecção se estabeleça por 48 horas e, em seguida, extraia a cama da ferida de forma semelhante ao protocolo in vivo. Comece removendo cuidadosamente o curativo. Cortando o perímetro da ferida.
E separando-se da camada muscular. A amostra do leito da ferida pode ser dividida em várias seções para aumentar o número de amostras. Em seguida, coloque as amostras divididas em tubos de homogeneização vazios pré-pesados separados.
Pesar novamente o tubo e calcular o peso da amostra subtraindo o peso do tubo sem a amostra do peso do tubo com a amostra. Adicione um mililitro de PBS ao tubo de homogeneização contendo a amostra, e inverta suavemente o tubo algumas vezes para enxaguar. Remova a lavagem e descarte do PBS.
Adicione um mililitro de tratamento GH, ou PBS como controle negativo, e incubar por duas horas a 37 graus Celsius, com agitação a 80 RPM. Remova a bile da solução dispersa e coloque em um tubo de centrífuga separado de 1,5 mililitro. Isto contém as células dispersas.
Lave o tecido restante com um mililitro de PBS, como feito anteriormente, e descarte a lavagem pbs. Adicione um mililitro de PBS ao tecido restante e homogeneize a cinco metros por segundo, durante 60 segundos. Diluir em série tanto a solução de células dispersas quanto a amostra de tecido homogeneizado, pipetando 100 microliters da amostra em 900 microliters de PBS em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Vórtice a amostra diluída e continuar a diluição mais cinco vezes para um total de seis diluições. Coloque a amostra tubondo 10 microliters de cada diluição na área indicada em uma placa de ágar seletiva. Conte a UFC e calcule por cento de dispersão dividindo a UFC dispersa pelo total da UFC, e multiplicando por 100.
Neste experimento, camundongos webster suíços de oito a 10 semanas foram infectados com 10 a a quarta UFC de PA01 carregando a luminescence plasmid PQF50-lux. A infecção foi autorizada a estabelecer-se por 48 horas antes de administrar três tratamentos de 30 minutos de PBS como controle de veículo, ou 10% GH como um tratamento experimental para digerir o EPS biofilme. Mostrados na seção A, os camundongos foram imagedos pré-tratamento, logo após o tratamento, e às 10 e 20 horas após o tratamento.
Usando o IVIS, uma infecção estabelecida pode ser visualizada dentro do leito da ferida gerando um sinal bioluminescente brilhante. A dispersão de bactérias para fora do leito da ferida pode ser visualizada imediatamente após o tratamento de GH, mas não após o tratamento da PBS. A disseminação bacteriana nos órgãos também pode ser vista colocando o rato de lado para a imagem, como mostrado nos painéis inferiores.
Na seção B, imagens dos camundongos tratados com PBS e GH demonstraram um aumento no sinal luminescente em 20 horas após o tratamento, em comparação com o pré-tratamento. No entanto, ainda é importante quantificar a UFC devido ao limiar de detecção de uma luminescência no IVIS. Às 20 horas após o tratamento, os camundongos foram eutanizados e os leitos e baços foram coletados para enumerar a UFC por grama de tecido.
A seção C mostra a carga bacteriana no leito da ferida, enquanto a seção D mostra a carga bacteriana nos baços. Esses dados sugerem disseminação disseminada das bactérias dispersas, uma vez que as bactérias só foram detectadas nos baços dos camundongos tratados com a solução GH direcionada ao EPS. Embora esses protocolos sejam muito úteis, existem algumas limitações.
Em primeiro lugar, deve-se notar que há uma limitação de detecção com o sistema de imagem in vivo, ou IVIS. Uma diminuição no sinal luminescente pode ser vista quando as bactérias entram em fase estacionária. Por isso, é importante coletar tecidos de interesse e medir a UFC presente, pois pode haver uma desconexão entre a luminescência e a UFC enumeradas.
No entanto, o IVIS é útil para visualizar a eficácia do tratamento ao longo de um estudo, sem ter que realmente eutanásia o animal. Outra limitação a ser considerada é a exigência de um monitoramento próximo das ataduras. As ataduras são necessárias para reduzir a cicatrização contratil, bem como manter a ferida estéril de outras bactérias.
As ataduras precisarão ser substituídas com frequência, o que pode levar ao desbridamento acidental da ferida e oportunidade de contaminação. Esses protocolos descrevem novos métodos para estudar a bile da dispersão, e a avaliação da bile terapêutica dos agentes dispersos. Esses modelos permitem o desenvolvimento de infecções complexas associadas a biofilmes polimicrobianos que imitam infecções humanas clinicamente relevantes.
Nossa esperança é que esses protocolos sejam utilizados e refinados para promover o desenvolvimento de agentes de dispersão anti-biofilme para uso terapêutico.
