Microbiologi e medici delle malattie infettive stanno iniziando a rendersi conto di quanto siano importanti le infezioni associate al biofilm nelle malattie croniche. Il NIH ha persino affermato che oltre l'80% delle infezioni croniche è dovuto a biofilm batterici. Questo ha insistito sull'enfasi posta sull'affrontare il biofilm e sullo sviluppo di terapie che affrontino il problema del biofilm.
E una lotta che queste terapie si concentrano sulla dispersione delle cellule batteriche che si trovano nei biofilm dal biofilm in modo che possano essere uccise più facilmente. Ma al momento non ci sono molti protocolli nella letteratura che affrontano come determinare l'efficacia di un tale agente di dispersione. Quindi sentiamo che questo è un buon protocollo da usare.
È un tipo di infezione batterica associata al biofilm. E pensiamo anche che possa essere ottimizzato abbastanza facilmente per studiare molti tipi diversi di specie batteriche, e come formano biofilm e si disperdono, così come diversi agenti di dispersione. E pensiamo che sia importante consegnarlo in formato video, perché abbiamo visto che ci sono sfumature soprattutto per la consegna dell'agente che abbiamo trovato lavorare in modo ottimale nei topi.
Per iniziare, valutare il piano dell'anestesia con il dito del dito del piedi e monitorando la frequenza respiratoria e lo sforzo. Radere la superficie dorsale e applicare una crema depilatoria sulla regione rasata per 10 minuti o secondo le istruzioni del prodotto. Rimuovere delicatamente la crema depilatoria.
E assicurarsi che la pelle sia asciutta. Utilizzando un marcatore a prova di alcol, disegnare un cerchio con un diametro di 1,5 centimetri verso la regione posteriore della schiena. Per la gestione del dolore, somministrare 0,05 millilitri di lidocaina per via sottocutanea nell'area da asportare.
E 0,02 millilitri di buprenorfina sottocutaneamente nella collotta del collo. Attendere 10 minuti per garantire che la gestione del dolore sia raggiunta. Prima dell'escissione, disinfettare la superficie dorsale usando un tampone alcolico.
Mantenere un campo chirurgico sterile durante tutta la procedura e utilizzare strumenti autoclavati e guanti sterili per limitare la contaminazione. Somministrare una ferita alla pelle incisionale a pieno spessore al livello del muscolo panniculo, con forbici chirurgiche. Dopo l'escissione, coprire immediatamente la ferita con una medicazione semipermeabile in poliuretano.
Separare accuratamente il supporto dalla medicazione utilizzando due forcep a punta fine, se applicabile. Iniettare circa 10 al quarto CFU di batteri e 100 microlitri PBS sotto la medicazione e sul letto della ferita per stabilire un'infezione. Si noti che le ferite possono anche essere infettate contemporaneamente da più specie di batteri e / o funghi, o posizionando biofilm preformati o persino tessuti di debridement estratti dai pazienti sul letto della ferita.
Dopo l'infezione, mettere i topi in gabbie sopra gli asciugamani di carta per evitare che i topi asfissiino sul materiale da letto. Posizionare le gabbie sulle pastiglie riscaldanti e monitorare i topi fino a quando non hanno riacquistato il riflesso di destra. Rimuovere l'tovagliolo di carta a questo punto.
Lasciare che le infezioni della ferita stabiliscano per 48 ore. Ispezionare quotidianamente la medicazione alla ricerca di lacrime in aree di non aderenza e sostituirla se necessario. Posizionare i topi sotto anestesia isoflurana al 3% e un litro al minuto di ossigeno, mentre somministrano trattamenti.
Iniettare 200 microlitri di soluzione enzimatica o controllo PBS sulla ferita sollevando la pelle leggermente anteriore della ferita con le flessori, perforando accuratamente la pelle sollevata con la siringa e iniettando lentamente la soluzione nell'area tra il letto della ferita e la medicazione. Per assicurarsi che l'intero letto avvolto sia coperto da soluzione, sollevare delicatamente la medicazione con le forcep, allontanandolo dal letto della ferita, mentre si inietta lentamente la soluzione. Dopo il trattamento, riposizionare i topi in gabbia per 30 minuti.
Dopo 30 minuti di esposizione al trattamento, riastetizzare i topi con isoflurane e aspirare la soluzione rimanente con una siringa, forando nella stessa area di prima. Si noti che questa soluzione aspirata contiene cellule batteriche disperse, che possono essere salvate per varie analisi a valle. Somministrare il secondo e il terzo trattamento di irrigazione come è stato fatto per il primo utilizzando ogni volta una nuova siringa.
Se un ceppo luminescente di batteri viene utilizzato per avviare l'infezione, un sistema di imaging in vivo può essere utilizzato per visualizzare la dispersione dal letto della ferita. Per l'analisi, aprire le immagini nel software IVIS e selezionare l'area da analizzare con la tavolozza degli strumenti. Per tenere conto dello sfondo, posizionare un cerchio sullo sfondo di un'immagine e quindi posizionare lo stesso cerchio di dimensioni sopra il letto della ferita per ogni mouse.
Nella tavolozza degli strumenti selezionare Misura ROM e caricare la tabella delle misure in un foglio di calcolo. Sottrarre la lettura del cerchio di sfondo da ciascuna delle misurazioni del letto della ferita per calcolare la luminescenza per ogni campione. Dopo l'eutanasia umana, raccogliere il tessuto del letto della ferita rimuovendo delicatamente la medicazione con forcelle sterili e tagliando intorno al perimetro del letto della ferita con forbici chirurgiche sterili.
Utilizzare le forcelle per sollevare delicatamente un'estremità del letto della ferita, quindi utilizzare le forbici per tagliare il campione di tessuto lontano dallo strato muscolare. Posizionare il campione di tessuto in un tubo di omogeneizzazione pre-pesato da due millilitri contenente un millilitro di PBS. Pesare nuovamente il tubo dopo aver inserito il campione.
Per raccogliere la milza, posizionare il mouse in una posizione anatomica supina e fissare fissando le estremità a una superficie di dissezione. Immergere l'area da sezionare con 70% di etanolo per aiutare a prevenire la contaminazione. Fare una piccola incisione perpendicolare alla linea mediana con forbici chirurgiche nel derma dell'addome inferiore.
Assicurarsi di tirare la pelle su e lontano dagli organi interni. Continuare l'incisione lungo la linea mediana fino a raggiungere lo sterno. Una volta esposta la cavità peritoneale e visibili gli organi interni, separare la milza dal tessuto connettivo e posizionarla in un tubo di omogeneizzazione prepesato separato.
Pesare nuovamente il tubo dopo aver inserito la milza. Omogeneizzare i campioni a cinque metri al secondo, per 60 secondi, due volte. Per enumerare la CFU, diluire e individuare in serie i campioni omogeneizzati.
Diluire serialmente con tubi 100 microlitri del campione omogeneizzato in 900 microlitri di PBS e un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Vortice prima di continuare la diluizione con tubi 100 microlitri del campione diluito in un tubo separato contenente 900 microlitri di PBS. Ripetere questi passaggi fino a quando non vengono raggiunte sei diluizioni.
Pipetta 10 microlitri di ogni diluizione sull'area indicata su una piastra di agar come mostrato. Se è richiesta una quantificazione CFU più precisa, stendere 100 microlitri di ogni diluizione del campione su piastre di agar separate. Ferire e infettare i topi con circa 10-quarta CFU di batteri, come descritto nel protocollo in vivo.
Consentire all'infezione di stabilire per 48 ore, quindi estrarre il letto della ferita in modo simile al protocollo in vivo. Iniziare rimuovendo attentamente la medicazione. Taglio intorno al perimetro della ferita.
E separarsi dallo strato muscolare. Il campione del letto della ferita può essere diviso in più sezioni per aumentare il numero di campioni. Quindi posizionare i campioni divisi in tubi di omogeneizzazione vuoti pre pesati separati.
Pesare nuovamente il tubo e calcolare il peso del campione sottraendo il peso del tubo senza il campione dal peso del tubo con il campione. Aggiungere un millilitro di PBS al tubo di omogeneizzazione contenente il campione e invertire delicatamente il tubo alcune volte per risciacquare. Rimuovere il lavaggio e lo scarto PBS.
Aggiungere un millilitro di trattamento gh, o PBS come controllo negativo, e incubare per due ore a 37 gradi Celsius, con scuotimento a 80 RPM. Rimuovere la bile dalla soluzione di dispersione e posizionarsi in un tubo di centrifuga separato da 1,5 millilitri. Contiene le celle disperse.
Lavare il tessuto rimanente con un millilitro di PBS, come fatto in precedenza, e scartare il lavaggio PBS. Aggiungere un millilitro di PBS al tessuto rimanente e omogeneizzare a cinque metri al secondo, per 60 secondi. Diluire in serie sia la soluzione di cellule disperse che il campione di tessuto omogeneizzato con l'intubazione di 100 microlitri del campione in 900 microlitri di PBS in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri.
Vortice il campione diluito e continuare la diluizione altre cinque volte per un totale di sei diluizioni. Individuare il campione con tubi 10 microlitri di ogni diluizione sull'area indicata su una piastra di agar selettiva. Contare la CFU e calcolare la dispersione percentuale dividendo la CFU dispersa per la CFU totale e moltiplicando per 100.
In questo esperimento, da otto a 10 settimane femmine di topi Webster svizzeri sono stati infettati da 10 al quarto CFU di PA01 che trasportava il plasmide luminescenza PQF50-lux. L'infezione è stata autorizzata a stabilire per 48 ore prima di amministrare tre trattamenti di 30 minuti di PBS come controllo del veicolo, o 10%GH come trattamento sperimentale per digerire il biofilm EPS. Mostrato nella sezione A, i topi sono stati foto-pre-trattamento, direttamente dopo il trattamento, e a 10 e 20 ore dopo il trattamento.
Utilizzando IVIS, un'infezione accertata può essere visualizzato all'interno del letto della ferita generando un segnale bioluminescente luminoso. La dispersione dei batteri dal letto della ferita può essere visualizzato immediatamente dopo il trattamento con GH, ma non dopo il trattamento PBS. La diffusione batterica negli organi può anche essere vista posizionando il topo su un lato per l'imaging, come mostrato nei pannelli inferiori.
Nella sezione B, le immagini dei topi trattati con PBS e GH hanno dimostrato un aumento del segnale luminescente a 20 ore dopo il trattamento, rispetto al pretrattamento. Tuttavia, è ancora importante quantificare la CFU a causa della soglia di rilevamento di una luminescenza in IVIS. A 20 ore dopo il trattamento, i topi sono stati eutanasiati e i letti delle ferite e le milza sono stati raccolti per enumerare cfu per grammo di tessuto.
La sezione C mostra la carica batterica nel letto della ferita, mentre la sezione D mostra la carica batterica nelle milza. Questi dati suggeriscono la diffusione diffusa dei batteri dispersi, poiché i batteri sono stati rilevati solo nelle milza dei topi trattati con la soluzione GH mirata all'EPS. Sebbene questi protocolli siano molto utili, ci sono alcune limitazioni.
In primo luogo, va notato che c'è una limitazione di rilevamento con il sistema di imaging in vivo, o IVIS. Una diminuzione del segnale luminescente può essere vista quando i batteri entrano in fase stazionaria. Pertanto è importante raccogliere tessuti di interesse e misurare il CFU presente, in quanto può esserci una disconnessione tra la luminescenza e la CFU enumerata.
Tuttavia, IVIS è utile per visualizzare l'efficacia del trattamento durante uno studio, senza dover effettivamente eutanasiare l'animale. Un'altra limitazione da prendere in considerazione è l'esigenza di un attento monitoraggio delle bende. Le bende sono necessarie per ridurre la guarigione contrattile e mantenere sterile la ferita da altri batteri.
Le bende dovranno essere sostituite spesso, il che può portare a debridement accidentali della ferita e opportunità di contaminazione. Questi protocolli descrivono nuovi metodi per studiare la bile dalla dispersione e la valutazione della bile terapeutica dagli agenti dispersivi. Questi modelli consentono lo sviluppo di complesse infezioni associate al biofilm polimicrobico che imitano infezioni umane clinicamente rilevanti.
La nostra speranza è che questi protocolli siano utilizzati e perfezionati per promuovere lo sviluppo di agenti di dispersione anti-biofilm per uso terapeutico.
