Criação e manutenção de um biobanco vivo como fazemos. Introdução. Os biobancos tradicionais geralmente contêm amostras de tecido e sangue não viáveis. Apesar de refletir adequadamente a diversidade das populações de pacientes com câncer e permitir análises genéticas e histológicas, elas são inadequadas para ensaios pré-clínicos que avaliam estratégias terapêuticas.
Um biobanco integrador também a modelos derivados do paciente supera essas limitações. Permitindo assim testes funcionais para medicina de precisão. Aquisição de amostras.
Para o biobanco do câncer colorretal e pancreático, eleger casos com diagnóstico comprovado, bem como tamanho tumoral suficiente, concent informado do paciente é obrigatório. Antes do início da cirurgia, desenhe 20ml de sangue usando uma seringa heparinizada e 7,5ml adicionais com uma monovette de soro. Processamento de soro e isolamento de PBL.
Após centrifugação a 1, 128 RCF por 15 minutos a quatro graus o soro é aliquotado em um crioboto pré-rotulado e diretamente submerso em nitrogênio líquido. O sangue heparinizado é transferido para um tubo de polipropileno e diluído com 15ml de PBS. Use uma pipeta sorológica para lentamente colocar a mistura com 15ml de Pancoll.
Após centrifugação gradiente de densidade, a camada opaca contendo as células mononucleares é tomada com uma pipeta sorológica e transferida para um novo tubo PP. Depois de lavar com PBS e pelotar as células mononucleares por centrifugação, descarte o supernatante e resuspenque a pelota em meio congelador e dispense em criotubos pré-rotulados. Transfira os tubos para um recipiente de resfriamento adequado para congelamento lento com um grau por minuto e armazene temporariamente a 80 graus.
Processamento de tecidos. Assim que a amostra de tecido for resseccionada pelo cirurgião, coloque-a em um recipiente adequado. Evite em todas as circunstâncias que o tecido esteja coberto de formalina.
Transporte o mais rápido possível para a patologia para excisão de material tumoral não relevante para avaliação patológica das margens de ressecção. A peça do tumor deve ser tratada o mais asséptica possível. Além disso, obtenha uma amostra de tecido saudável e coloque ambos em tubos separados pré-preenchidos com solução de armazenamento de tecidos no gelo.
Retorne imediatamente ao laboratório para iniciar o processamento de tecidos em condições estéreis. A peça de tecido é colocada em um prato plástico estéril cheio de solução de armazenamento de tecidos para evitar a proficação. Em primeiro lugar, extireta uma ou mais peças do tamanho de pinhead para congelamento de estalos, dependendo do tamanho da amostra de tecido obtida.
Coloque o tecido nativo em criotubos pré-rotulados e submerse imediatamente em nitrogênio líquido. Corte o tecido restante em cubos de três por três por três milímetros cúbicos. Leve em conta que o tecido necrosado deve ser dissecado completamente, mas não deve ser descartado.
Organize os cubos em quadruplos para determinar o número de alíquotas para armazenamento vital. Rotule um número adequado de criotubos e preencha-os com meio de congelador de 1,5ml cada. Uma vez que o DMSO no meio congelador é citotóxico, realizou os próximos passos de forma rápida e sem interrupção.
Use uma lâmina de bisturi para colher quatro pedaços de tecido por tubo. Certifique-se de que todas as peças estão completamente submersas em meio congelador idealmente na parte inferior do tubo e congele rapidamente os tubos usando um recipiente de congelamento. Prossiga da mesma forma com o espécime saudável.
Para armazenamento a longo prazo, armazene todas as alíquotas em um tanque de nitrogênio líquido. Cultura celular. Triture os restos do processamento do tecido tumoral, incluindo as porções necrosadas com as lâminas de bisturi o menor possível.
Coloque um coador de células na parte superior de um tubo PP estéril e aspire a suspensão com uma pipeta sorológica para passar pelo coador celular. Use o êmbolo de uma única seringa de uso único para pressionar os restos do tecido através do coador celular para gerar uma única suspensão celular. Enxágüe com PBS e repita estes passos até que não haja mais material.
Remova o coador de células e centrifufique a suspensão a 180 RCF por sete minutos. Enquanto isso, prepare uma placa de seis poços pré-revestida de colágeno com diferentes composições de mídia para aumentar a probabilidade de crescimento tumoral. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota na PBS e dispense 500 microliters por poço.
Depois, coloque a placa em uma incubadora padrão. Geração de xenoenxerto derivado do paciente. Para a geração de xenoenxertos derivados do paciente em camundongos imunocomprometidos, os animais devem ser mantidos em um ambiente específico livre de patógenos.
Use equipamentos de proteção individual compostos por esfregões, avental, máscara facial, tampa de cabelo e luvas. Depois de organizar seu espaço de trabalho, pegue a amostra de tumor desejo do recipiente de nitrogênio líquido. Encha um tubo PP fresco com PBS de 35ml e depois lave o processo de descongelamento cuidadosamente e incline o tubo criogênico para cima e para baixo.
Assim que o conteúdo ficar macio, despeje no PBS e enxágue as peças tumorais. Descarte a maioria do PBS e esvazie os cubos na tampa. Coloque um prato de plástico estéril em uma bolsa de gelo e adicione uma gota de 100 microliter Matrigel.
Use fórceps para colocar os pedaços do tumor no Matrigel e incubar o tumor por 10 minutos. Enquanto isso, anestesia dois ratos. Verifique a profundidade da anestesia beliscando o pé do animal.
Qualquer movimento indica anestesia insuficiente e requer alguma espera ou dosagem adicional. Aplique pomada ocular, belisque o mouse pelo pescoço e injete um microchip subcutâneamente. Conduza os seguintes passos em paralelo.
Desinfete os flancos dos ratos e faça uma pequena incisão de pele com uma tesoura Metzenbaum listrada e forme um bolso subcutâneo por preparação sem cortes. Use fórceps anatômicos para inserir as peças tumorais. Certifique-se de que a peça está colocada na parte traseira do bolso da pele.
Aspire o Matrigel restante e distribua igualmente para todos os quatro bolsos. Aguarde a cura do gel e feche a pele com suturas de botão único sem danificar as peças tumorais com a agulha. Corte a rosca o mais curto possível acima do nó e aplique o molho spray para evitar o noying das suturas.
Escaneie o microchip e adicione as informações do tumor ao banco de dados para posterior identificação do animal. Prepare uma gaiola com roupas de cama frescas e material de aninhamento, colocou os ratos na frente de uma lâmpada infravermelha e monitore o animal até que a anestesia diminua. Explantação de PDX.
Depois que o tumor PDX atingiu o tamanho necessário, o camundongo é eutanizado por asfixia de CO2 e posterior luxação cervical. Dissecar cuidadosamente a pele do tumor e remover completamente o PDX. Resultados representativos.
Coloque um tumor em um prato plástico estéril e use lâminas de bisturi estéreis para processamento posterior. Corte orifício com as fatias, coloque-as em um de histologia e submerse em formalina para gerar espécime embutido para parafina para avaliação histológica mais tarde. Transfira o resto do tumor para a solução de armazenamento de tecidos e crie uma nova amostra congelada de preservação vital e instantânea para o biobanco.
Além disso, use os restos do tumor PDX análogo à cultura celular do capítulo para estabelecer linhas de células tumorais secundárias. Para gerar mais PDX, transfira duas ou mais peças tumorais com Matrigel para um novo mouse receptor, como mostrado anteriormente. conclusão. Por meio do protocolo apresentado, conseguimos até agora estabelecer nove linhas de células cancerígenas coloráticas e mais de 100 colorretais derivadas do paciente, além de 19 modelos de PDX colorretal e mais de 150 colorretais.
