יצירה ותחזוקה של ביובנק חי איך אנחנו עושים את זה. מבוא. ביובנקים מסורתיים מכילים בדרך כלל דגימות רקמות ודם שאינן בנות קיימא. למרות המשקף כראוי את המגוון של אוכלוסיות חולי סרטן ומאפשר ניתוחים גנטיים והיסטולוגיים, הם אינם מתאימים מבחנים פרה-קוליניים להערכת אסטרטגיות טיפוליות.
ביובנק המשלב גם מודלים שמקורם בחולה מתגבר על מגבלות אלה. ובכך מאפשר בדיקות פונקציונליות לרפואה מדויקת. רכישה לדוגמה.
עבור biobanking של סרטן המעי הגס והלבלב, לבחור מקרים עם אבחון מוכח, כמו גם גודל גידול מספיק, תבלין הודיע של המטופל הוא חובה. לפני תחילת הניתוח, לצייר 20 מ"ל של דם באמצעות מזרק הפריני ו 7.5 מ"ל נוספים עם מונובט בסרום. עיבוד סרום ובידוד PBL.
לאחר צנטריפוגה ב 1, 128 RCF במשך 15 דקות בארבע מעלות הסרום הוא aliquoted ב cryotube שכותרתו מראש שקוע ישירות חנקן נוזלי. הדם הפריני מועבר לצינור פוליפרופילן ומדולל עם PBS 15 מ"ל. השתמש פיפטה סרולוגית לאט underlay את התערובת עם 15ml Pancoll.
לאחר צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות, השכבה האטומה המכילה את התאים המונו-גרעיניים נלקחת עם פיפטה סרולוגית ומועברת לצינור PP חדש. לאחר שטיפה עם PBS ו pelleting את התאים mononuclear על ידי צנטריפוגה, להשליך את supernatant ו resuspend גלולה במדיום מקפיא לוותר על cryotubes שכותרתו מראש. מעבירים את הצינורות למיכל קירור המתאים להקפאה איטית עם מעלה אחת לדקה ומאחסנים זמנית ב-80 מעלות.
עיבוד רקמות. ברגע שדגימה רקמה הוא resected על ידי המנתח, לשים אותו לתוך מיכל מתאים. הימנע בכל הנסיבות כי הרקמה מכוסה פורמלין.
הובלה מהירה ככל האפשר לפתולוגיה לכריתת חומר הגידול אינה רלוונטית להערכה פתולוגית של שולי הריתוס. חתיכת הגידול צריך להיות מטופל אספטי ככל האפשר. יתר על כן, להשיג דגימה של רקמה בריאה ומניחים הן בצינורות נפרדים ממולאים מראש עם פתרון אחסון רקמות על קרח.
חזור מיד למעבדה כדי להתחיל עיבוד רקמות בתנאים סטריליים. חתיכת הרקמה מונחת על צלחת פלסטיק סטרילית מלאה בתמיסת אחסון רקמות כדי למנוע התייבשות. קודם כל, בלו אחד או יותר חתיכות בגודל pinhead עבור הצמד הקפאה בהתאם לגודל של דגימת הרקמה המתקבלת.
מניחים את הרקמה המקומית לתוך cryotubes שכותרתו מראש לטבול מיד חנקן נוזלי. חותכים את הרקמה הנותרת לקוביות של שלוש על שלוש על שלושה מילימטרים מעוקבים. קח בחשבון כי רקמה נמקית חייב להיות מנותח לחלוטין אבל לא צריך להיות מושלך.
סדר את הקוביות בארבעה כדי לקבוע את מספר aliquots עבור אחסון חיוני. תווית מספר נאות של cryotubes ולמלא אותם מראש עם 1.5 מ"ל מקפיא בינוני כל אחד. מאז DMSO במדיום המקפיא הוא ציטוטוקסי, ביצע את השלבים הבאים במהירות וללא הפרעה.
השתמש להבי אזמל כדי לגרוף את ארבע חתיכות רקמה לכל צינור. ודא כי כל החלקים שקועים לחלוטין במקפיא בינוני באופן אידיאלי בתחתית הצינור במהירות להקפיא צינורות באמצעות מיכל הקפאה. המשך באותו אופן עם הדגימה הבריאה.
לאחסון ארוך טווח, אחסנו את כל האליטרוטים במיכל חנקן נוזלי. תרבות תאים. טוחנים את שרידי עיבוד רקמת הגידול, כולל החלקים הנמקיים עם להבי האזמל קטנים ככל האפשר.
מניחים מסננת תאים בחלק העליון של צינור PP סטרילי ושואפים את ההשעיה עם פיפטה סרולוגית לעבור דרך מסננת התא. השתמש בוכנה של מזרק לשימוש יחיד ללחוץ על הרקמה נשאר דרך מסננת התא כדי ליצור השעיה תא יחיד. יש לשטוף באמצעות PBS ולחזור על שלבים אלה עד שלא יישאר חומר.
הסר את מסננת התא וצנטריפוגה ההשעיה ב 180 RCF במשך שבע דקות. בינתיים, להכין קולגן מצופה מראש שש באר צלחת עם קומפוזיציות מדיה שונות כדי להגדיל את ההסתברות של גידול לגדול. השלך את supernatant ו resuspend גלולה ב PBS ולחלק 500 microliters לכל באר.
לאחר מכן, מניחים את הצלחת באינקובטור סטנדרטי. דור של קסנוגרפט שמקורו בחולה. עבור הדור של קסנוגרפטים שמקורם בחולה בעכברים immunocompromised, בעלי חיים צריכים להישמר בסביבה ספציפית ללא פתוגן.
ללבוש ציוד מגן אישי הכולל קרצוף, סינר, מסכת פנים, כיסוי שיער וכפפות. לאחר סידור סביבת העבודה שלך, לקחת את דגימת הגידול תשוקה ממיכל חנקן נוזלי. מלא צינור PP טרי עם PBS 35 מ"ל ולאחר מכן לשטוף את תהליך ההפשרה בזהירות להטות את צינור cryo למעלה ולמטה.
ברגע התוכן הופך רפוי, שפכו לתוך PBS ולשטוף את חתיכות הגידול. השלך את רוב PBS ורוקן את הקוביות לתוך המכסה. מניחים צלחת פלסטיק סטרילית על חבילת קרח ומוסיפים טיפה של 100 מיקרוליטר Matrigel.
השתמש מלקחיים למקם את חתיכות הגידול Matrigel ולהדגיר את הגידול במשך 10 דקות. בינתיים, תחטא שני עכברים. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת הרגל של החיה.
כל תנועה מצביעה על הרדמה לא מספקת ודורשת המתנה מסוימת או מינון נוסף. החל משחת עיניים, לצבוט את העכבר על ידי הצוואר ולהזריק שבב תת עורי. בצע את השלבים הבאים במקביל.
לחטא את האגפים של העכברים ולעשות חתך עור קטן עם מספריים Metzenbaum פסים וליצור כיס תת עורי על ידי הכנה בוטה. השתמש מלקחיים אנטומיים כדי להכניס את חתיכות הגידול. ודא כי החתיכה ממוקמת בקצה האחורי של כיס העור.
שאפתן את Matrigel הנותרים ולחלק באופן שווה לכל ארבעת הכיסים. המתינו לריפוי הג'ל וסגרו את העור בתפרים עם כפתור יחיד מבלי לפגוע בחלקי הגידול עם המחט. חותכים את החוט קצר ככל האפשר מעל הקשר ולהחיל רוטב ספריי כדי למנוע נוי של התפרים.
סרוק את השבב והוסיף את מידע הגידול למסד הנתונים לזיהוי מאוחר יותר של החיה. מכינים כלוב עם מצעים טריים וחומר קינון, מניחים את העכברים מול מנורת אינפרא אדום ומנטרים את החיה עד שההרדמתה שככה. הסבר של PDX.
לאחר הגידול PDX הגיע לגודל הנדרש, העכבר הוא מורדם על ידי חנק CO2 ונקע צוואר הרחם הבאים. לנתח בזהירות את העור מהגידול ולהסיר את PDX לחלוטין. תוצאות מייצגות.
מניחים גידול על צלחת פלסטיק סטרילית ומשתמשים בלהבי אזמל סטריליים לעיבוד נוסף. חותכים חור עם הפרוסות, מניחים אותם בקלטת היסטולוגיה ושקעים בפורמלין כדי ליצור דגימה משובצת פרפין להערכה היסטולוגית במועד מאוחר יותר. מעבירים את שאר הגידול לתמיסת אחסון רקמות ויוצרים דגימה קפואה חדשה שהשתמרה באופן חיוני ונשברת עבור הביובנק.
בנוסף, השתמש בשרידי הגידול PDX מקביל לתרבות תא הפרק כדי להקים קווי תאים סרטניים משניים. כדי ליצור PDX נוסף, להעביר שתי חתיכות גידול או יותר עם Matrigel לעכבר נמען חדש כפי שמוצג קודם לכן. מסקנה. באמצעות הפרוטוקול שהוצג, הצלחנו עד כה להקים תשעה דגמי PDX של הלבלב ויותר מ-100 חולי המעי הגס, כמו גם 19 דגמי PDX בלבלב ומעל 150 צבעים.
