Reconhecemos as seguintes fontes de financiamento: NIH NINDS – K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), University of Virginia School of Medicine (JB).

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia.
1. Construção de eletrodo/cabo
<ol><li>Use um fio de aço inoxidável isolado unipolar (0,005" de diâmetro nu, 0,008" revestido) para fazer um eletrodo conectado com um conector de soquete feminino (conector de recipiente feminino 0,079).</li>
	<li>Use um cabo feito sob medida para conectar os animais ao amplificador.<ol>
<li>Conecte um conector masculino de 4 pinos (conector masculino de 0,079") à unidade de 4 canais ganha impedância correspondente ao amplificador operacional (op-amp). Conecte um resistor de 10K aos fios que se conectam à bateria de 9 V. Um fio de terra não conectado ao op-amp atua como o ponto médio da bateria.</li>
		<li>Conecte uma extremidade do cabo (AWG, 0,012" OD) ao op-amp e conecte a outra extremidade do cabo ao amplificador.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cirurgia de implantação de eletrodos
<ol><li>Anestesiar o filhote (pós-natal dia 9) com isoflurane de 4-5% em um capô de fluxo descendente. Antes do início do procedimento, injete os filhotes com bupivacaína (0,02-0,05 mL, 0,25% de infiltração local subcutânea).</li>
	<li>Uma vez que o animal esteja imóvel, transfira para um estágio estereotático com um cone de nariz. Use o lado inverso da barra de ouvido, pois ela é macia para manter a cabeça firme. Nesta idade, os filhotes não têm um ouvido totalmente desenvolvido para usar a extremidade pontiaguda da barra de ouvido.</li>
	<li>Abaixe o fluxo de isoflurane e mantenha-o em 2,5-3%. Fique de olho na respiração constante do filhote durante todo o procedimento cirúrgico. Aperte a cauda para verificar a resposta à dor e, em seguida, proceda à incisão.</li>
	<li>Esterilize a área de incisão no crânio com betadina e álcool (3 ciclos de iodo alternado e 70% de etanol). Drape a parte do corpo circundante de tal forma que a região de incisão é visível.</li>
	<li>Abra o couro cabeludo anterior-posterior ligeiramente acima dos olhos e retraia aproximadamente 0,5 cm de pele. Reposicione a cabeça do rato no estágio estereotaxico para que a pele puxe para fora expondo o crânio.</li>
	<li>Aplique peróxido de hidrogênio no crânio usando um cotonete e raspe o crânio limpo usando uma lâmina de bisturi. O crânio é muito macio; tenha cuidado ao raspar.</li>
	<li>Aplique uma gota (aproximadamente 50 μL) de adesivo e espalhe-a ao redor da área do crânio exposta usando seu aplicador. Exponha à luz UV por 40 s para definir o adesivo.</li>
	<li>Meça as coordenadas usando o bregma exposto como referência. Implante eletrodos bilateralmente na região ca1 do hipocampo [-3,5 mm Dorsal-Ventral (DV), ±2 mm Medial-Lateral (ML), -1,75 mm De profundidade (D)] e bilateralmente no córtex parietal [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] e um eletrodo de referência no cerebelo17. Use uma agulha de 32 G para criar um buraco na região marcada.</li>
	<li>Limpe o sangue da superfície do crânio. Eletrodos inferiores ligados ao conector do soquete feminino no cérebro com a ajuda do braço estereotaxic e fixação no lugar com acrílico dental. Implante o eletrodo no cérebro. O fone de ouvido do conector do soquete fica em cima do crânio colado por acrílico dentário.</li>
	<li>Injete cetoprofeno (5 mg/kg) subcutâneamente na região interescapular quando o eletrodo estiver fixo. Coloque os filhotes de volta com a mãe. NOTA: Introduza metade da ninhada com o fone de ouvido de uma vez para a mãe em vez de apresentá-los um de cada vez. Isso evitará que a mãe prejudique o fone de ouvido do filhote.</li>
</ol>3. Configuração e gravação do EEG (linha de base/pré-lesão)
<ol><li>Após 24 horas de recuperação após a implantação do eletrodo, coloque cada animal em uma câmara plexiglas personalizada (37 °C) para gravação de EEG. Esta câmara também servirá como uma câmara de hipóxia.</li>
	<li>Conecte filhotes na câmara a um sistema de monitoramento por vídeo-EEG através de um cabo flexível (cabo op-amp personalizado). NOTA: Com o fone de ouvido no lugar, os ratos são livremente móveis e não apresentam diferenças de comportamento. Uma vez fixados nos fios de eletrodo, os fios devem ser ajustados dentro da corda da câmara, a fim de fornecer a quantidade certa de folga para que o filhote possa se mover livremente por toda a câmara.</li>
	<li>Digitalize os dados do EEG a 1000 Hz com ganho de 1K usando um amplificador de grama. Revise o sinal EEG (filtro de passagem de banda entre 3-70 Hz) mais tarde usando software (por exemplo, LabChart Pro).</li>
	<li>Regisso EEG pré-lesão por 30 minutos antes de desconectar animais para procedimento de ligadura da artéria carótida.</li>
</ol>4. Ligamento da artéria carótida esquerda
<ol><li>Anestesiar o filhote (pós-natal dia 10) com isoflurane de 4-5% em um capô de fluxo descendente e colocá-los em configuração especialmente organizada em uma almofada de banho de água. Posicione o supino animal e proteja os membros dianteiros com fita adesiva.<ol>
<li>Reduza o fluxo de isoflurane para 2-3%. Belisque a cauda para obter resposta à dor e monitore a respiração durante todo o procedimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esterilizar a área de incisão (entre a mandíbula e a clavícula) no lado esquerdo do pescoço com betadina e álcool (3 ciclos de iodo alternado e 70% de etanol).</li>
	<li>Faça uma incisão de aproximadamente 1 cm de comprimento no lado esquerdo do pescoço usando microscisores. Usando um microscópio dissecando, retraia cuidadosamente o tecido subcutâneo e a pele para expor a artéria carótida. Tome cuidado para identificar o nervo vago (correndo lateralmente para a artéria) e delicadamente separá-lo e retraí-lo da artéria.</li>
	<li>Rosqueie uma sutura de seda estéril de 5 cm de comprimento sob a artéria usando microforceps. Amarre uma sutura dupla ao redor da artéria para ocluir o fluxo.</li>
	<li>Corte o excesso de sutura e feche a artéria exposta puxando para trás o tecido subcutâneo e a pele. Use o vínculo veterinário para selar a incisão.</li>
	<li>Coloque o animal de volta no monitoramento contínuo do EEG em uma câmara em temperatura ambiente, que é colocada em um colchão aquecido. Faça verificações de temperatura infravermelha do núcleo do filhote para evitar abrir a câmara. Deixe o animal se recuperar por 1h antes da hipóxia.</li>
</ol>5. EEG e hipóxia
<ol><li>Monitore continuamente o FiO2 (fração de oxigênio inspirado) dentro da câmara através de um monitor de oxigênio.</li>
	<li>Lave a câmara com 60 L/min de 100% N2 e 0,415 L/min para 100% O2. Uma vez que a saturação de oxigênio na câmara atinja 12%, diminua o fluxo de N2 para 10 L/min, mantendo o fluxo de O2 inalterado. Com pequenos ajustes, mantenha o FiO2 em 8% por 45 min.</li>
	<li>Após 45 min de exposição à hipóxia, retorne fio2 a 21%.</li>
	<li>Que os filhotes se recuperem na câmara e monitorem no EEG por 2h pós-hipóxia.</li>
	<li>Após o término do período de gravação, desconecte os ratos da gravação do EEG e retorne à mãe.</li>
</ol>6. Análise de EEG
<ol><li>Analise o arquivo EEG com vídeo no LabChart Pro. Um pesquisador cego marca o EEG para convulsões e padrões de fundo17. As convulsões são definidas como um evento eletrográfico que dura mais de 10 segundos com descargas de ondas acentuadas rítmica de alta frequência (≥3x de base) com clara evolução17.</li>
	<li>Tenha uma segunda revisão de pesquisador cego marcado eventos aleatoriamente para concordância.</li>
	<li>Revise o vídeo associado para cada evento eletrográfico marcado e analise de acordo com o escore de convulsão comportamental do roedor neonatal16. Resumidamente, essa pontuação varia de 0-6 (imobilidade ao comportamento tônico-clonic grave). Para caracterizar ainda mais a semiologia convulsiva, analise o comportamento de lateralidade (movimentos multifoca/bilaterais versus focal/unilateral versus misto).</li>
	<li>Crie um espectrograma de energia. Use um Fast Fourier Transform com uma janela de dados Cosine-Bell com um tamanho de 1024 pontos de dados. Crie um eixo x liso no espectrograma com a ajuda de uma sobreposição de janela de 87,5%. Expresse a potência como μV218.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vasudevan, C., Levene, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+aetiology+of+neonatal+seizures.">Epidemiology and aetiology of neonatal seizures.</a> Seminars in Fetal &amp; Neonatal Medicine. , (2013).</li><li>Volpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Seizures.">Neonatal Seizures.</a> Volpe's Neurology of the Newborn. , 275-321 (2018).</li><li>Shankaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+EKSNNR.+Childhood+outcomes+after+hypothermia+for+neonatal+encephalopathy.">Network EKSNNR. Childhood outcomes after hypothermia for neonatal encephalopathy.</a> New England Journal of Medicine. 366 (22), 2085-2092 (2012).</li><li>Pappas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+outcomes+after+neonatal+encephalopathy.">Cognitive outcomes after neonatal encephalopathy.</a> Pediatrics. 135 (3), 624-634 (2015).</li><li>van Schie, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse.">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric Neurology. 31 (4), 254-257 (2004).</li><li>Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Electroencephalographic+Monitoring+with+Radio-Telemetry+in+a+Rat+Model+of+Perinatal+Hypoxia-Ischemia+Reveals+Progressive+Post-Stroke+Epilepsy.">Continuous Electroencephalographic Monitoring with Radio-Telemetry in a Rat Model of Perinatal Hypoxia-Ischemia Reveals Progressive Post-Stroke Epilepsy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (1), 404-415 (2010).</li><li>Burnsed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Circuit+Activity+during+Neonatal+Hypoxic+-+Ischemic+Seizures+in+Mice.">Neuronal Circuit Activity during Neonatal Hypoxic - Ischemic Seizures in Mice.</a> Annals of Neurology. 86, 927-938 (2019).</li><li>Sampath, D., White, A. M., Raol, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neonatal+seizures+in+an+animal+model+of+hypoxic-ischemic+encephalopathy.">Characterization of neonatal seizures in an animal model of hypoxic-ischemic encephalopathy.</a> Epilepsia. 55 (7), 985-993 (2014).</li><li>Sampath, D., Valdez, R., White, A. M., Raol, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticonvulsant+effect+of+flupirtine+in+an+animal+model+of+neonatal+hypoxic-ischemic+encephalopathy.">Anticonvulsant effect of flupirtine in an animal model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.</a> Neuropharmacology. 123, 126-135 (2017).</li><li>Kang, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+sex-dependent+susceptibility+to+phenobarbital-resistant+neonatal+seizures:+role+of+chloride+co-transporters.">and sex-dependent susceptibility to phenobarbital-resistant neonatal seizures: role of chloride co-transporters.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-16 (2015).</li><li>Zanelli, S., Goodkin, H. P., Kowalski, S., Kapur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+transient+acute+hypoxia+on+the+developing+mouse+EEG.">Impact of transient acute hypoxia on the developing mouse EEG.</a> Neurobiology of Disease. 68, 37-46 (2014).</li><li>Lewczuk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EEG+and+behavior+patterns+during+experimental+status+epilepticus.">EEG and behavior patterns during experimental status epilepticus.</a> Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2017).</li><li>Wu, D., Martin, L. J., Northington, F. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+gradient+diffusion+MRI+reveals+unique+microstructural+information+in+normal+and+hypoxia-ischemia+injured+mouse+brains.">Oscillating gradient diffusion MRI reveals unique microstructural information in normal and hypoxia-ischemia injured mouse brains.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1366-1374 (2014).</li></ol>

Apresentamos um modelo para monitoramento contínuo de vídeo-EEG em camundongos neonatais durante convulsões hipoximic-isquêmicas. A análise de vídeo em conjunto com o EEG permite a caracterização da semiologia convulsiva. A análise do EEG permite a extração de espectrogramas de energia e análise de amplitude de fundo.
A colocação correta e cuidadosa de eletrodos é crucial neste protocolo, pois lesões durante a colocação de eletrodos ou colocação imprecisa podem afetar significativamente os resultados. A avaliação da atividade normal de EEG de base antes da lesão é primordial, pois sangramento ou lesão durante a colocação de eletrodos, embora raro, pode acontecer. Em segundo lugar, a fim de confirmar a colocação correta do eletrodo, os cérebros podem ser seccionados e examinados para trilhos de eletrodos na colocação adequada. Além disso, a não devolução de filhotes à mãe em grupos (individualmente) pode resultar em fones de ouvido eletrodos sendo danificados ou filhotes sendo mortos ou negligenciados pela mãe.
Uma limitação desse método é o limite de localização espacial de gravações de eletrodos de profundidade em um pequeno cérebro neonatal. Isso restringe a capacidade de localização de focos de apreensão específicos em gravações de EEG. Outra limitação nesse modelo de isquemia de hipóxia é a variabilidade da carga convulsiva. A variabilidade no tamanho da lesão e déficits comportamentais neste modelo de isquemia de hipóxia foi bem descrita anteriormente7,8,19. Não surpreende que essa variabilidade exista na carga convulsão (tanto duração de eventos de convulsão quanto número de eventos de apreensão). No entanto, consistentemente, 100% dos filhotes neste modelo apresentam convulsões durante a hipóxia. Por fim, a quantidade de tempo que os filhotes podem estar no monitoramento de EEG (longe da mãe) é limitada. Portanto, não podemos caracterizar convulsões contínuas com EEG contínuo em pontos posteriores relativos à lesão.
Embora tenhamos usado um modelo de apreensão de hipóxia-isquemia neste manuscrito, este método para monitoramento contínuo de vídeo-EEG em filhotes de camundongos neonatais poderia ser facilmente aplicado a outros modelos de doença/convulsão. As convulsões em roedores neonatais são difíceis de reconhecer com base apenas no comportamento, tornando importante o monitoramento por vídeo-EEG. Investigações futuras poderiam utilizar essas técnicas para analisar carga convulsão e semiologia em outros modelos de convulsão neonatal ou resposta a medidas terapêuticas e neuroprotetoras.

A encefalopatia isquêmica hipóxica (HIE) é uma condição que afeta 1,5 em 1000 recém-nascidos anualmente e é a causa mais comum de convulsões neonatais1,2. Os bebês que sobrevivem correm risco para várias deficiências neurológicas, como paralisia cerebral, deficiência intelectual e epilepsia3,4,5.
Os modelos animais desempenham um papel fundamental na compreensão e investigação da fisiopatologia da isquemia de hipóxia e convulsões neonatais6,7. Um modelo vannucci modificado é usado para induzir isquemia de hipóxia (OI) no pós-natal dia 10 (p10)7,8. Filhotes de rato dessa idade traduzem neurologicamente aproximadamente para o termo completo neonato humano9.
O monitoramento contínuo da eletroencefalografia por vídeo (EEG) utilizado em conjunto com este modelo de lesão permite maior compreensão e caracterização de convulsões isquêmicas hipoxicas neonatais. Estudos anteriores utilizaram vários métodos para análise de convulsões neonatais em roedores, incluindo gravações de vídeo, gravações limitadas de EEG e gravações de EEG de telemetria10,11,12,13,14,15,16. No manuscrito a seguir, discutimos em profundidade o processo de gravação contínua de EEG de vídeo em filhotes de camundongos durante a hipoxia-isquemia. Esta técnica de monitoramento contínuo de EEG em filhotes de camundongos neonatais pode ser aplicada a uma variedade de modelos de doenças e convulsões.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ball Point Applicator</td>
			<td>Metrex Research</td>
			<td>8300-F</td>
			<td>i-bond applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cranioplast (Powder/Resin)</td>
			<td>Coltene</td>
			<td>H00383</td>
			<td>Perm Reline/Power</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Bond</td>
			<td>Kulzer GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOOK Silk Suture</td>
			<td>Surgical Specialities Corporation</td>
			<td>SP115</td>
			<td>LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS-5168 Botvin Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS5168</td>
			<td>Forcep for surgery/ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS-5138 Graefe Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS5138</td>
			<td>Forcep for surgery/ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light for I-Bond</td>
			<td>Blast Lite By First Media</td>
			<td>BL778</td>
			<td>UV ligth for I-bond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Microdissecting Scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS5618</td>
			<td>Scissor for ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Bond</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>Vet Glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPOXIA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxidial</td>
			<td>Starr Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen sensor</td>
			<td>Medical Products</td>
			<td></td>
			<td>MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EEG RECORDING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female receptacle connector 0.079&#34;</td>
			<td>Mill-Max Manufacturing Corp</td>
			<td>832-10-024-10-001000</td>
			<td>Ordered from Digikey</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass Amplifier</td>
			<td>Natus Neurology Incorporated</td>
			<td></td>
			<td>Grass Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart Pro</td>
			<td>ADI Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software to run the system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Socket Connector 0.079&#34;</td>
			<td>Mill-Max Manufacturing Corp</td>
			<td>833-43-024-20-001000</td>
			<td>Ordered from Digikey</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational Amplifier</td>
			<td>Texas Instruments, Dallas, TX, USA</td>
			<td>TLC2274CD</td>
			<td>TLC2274 Quad Low&#8208;Noise Rail&#8208;to Rail Operational Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational Amplifier</td>
			<td>Texas Instruments, Dallas, TX, USA</td>
			<td>TLC2272ACDR</td>
			<td>TLC2274 Quad Low&#8208;Noise Rail&#8208;to Rail Operational Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel wire</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>791400</td>
			<td>0.005&#34; Bare/0.008&#34; Coated 100 ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Flexible Wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9564T1</td>
			<td>36 Gauze wire of various color</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous video electroencephalogram during hypoxia-ischemia in neonatal mice

A isquemia de hipóxia é a causa mais comum de convulsões neonatais. Modelos animais são cruciais para a compreensão dos mecanismos e fisiologia subjacentes às convulsões neonatais e à isquemia de hipóxia. Este manuscrito descreve um método de monitoramento contínuo de eletroencefalograma de vídeo (EEG) em camundongos neonatais para detectar convulsões e analisar o fundo do EEG durante a isquemia de hipóxia. O uso de vídeo e EEG em conjunto permite a descrição da semiologia da convulsão e a confirmação de convulsões. Este método também permite a análise de espectrogramas de energia e tendências de padrão de fundo EEG durante o período de tempo experimental. Neste modelo de isquemia de hipóxia, o método permite o registro de EEG antes da lesão para obter uma linha de base normativa e durante a lesão e recuperação. O tempo total de monitoramento é limitado pela incapacidade de separar filhotes da mãe por mais de quatro horas. Embora tenhamos utilizado um modelo de convulsões hipoxica-isquêmicas neste manuscrito, este método para monitoramento de vídeo neonatais poderia ser aplicado a diversos modelos de doenças e convulsões em roedores.

Semiologia convulsiva
A exposição à hipóxia neonatal resulta em convulsões generalizadas e focais em camundongos (Figura 1A-C). Gravações de EEG de vídeo permitem que achados eletrográficos sejam correlacionados ao comportamento em vídeo. Esses comportamentos foram pontuados utilizando-se um escore de apreensão comportamental de roedores neonatais (BSS)16. Além da BSS, categorizamos eventos com base em se o comportamento foi focal/unilateral, bilateral ou misto (Figura 1B).
Neste modelo, os camundongos geralmente apresentavam 3 padrões de semiologia convulsiva: 1) repetitivo circulando ao lado da ligadura com extensão de extremidades contralaterais, 2) perda de postura com flexão corporal e cauda enrolada para lado de ligadura, ou 3) perda de postura com remando unilateral ou bilateral de extremidades (gravidade e comprimento variados). A maioria dos eventos observados envolveu comportamentos focais/unilaterais ou mistos (Figura 1B). Além disso, durante o período hipóxico, um subconjunto de camundongos apresentou atividade convulsiva não convulsiva, onde o filhote estava imóvel com atividade convulsiva sustentada no EEG (Figura 1C).
Gravações eletrográficas
A gravação do EEG foi iniciada 30 minutos antes da ligadura carótida, a fim de obter uma linha de base pré-lesão. A atividade da linha de base (Figura 1A e Figura 2A) foi semelhante ao fundo descrito anteriormente em filhotes de rato p1017. Após a ligadura, os filhotes foram imediatamente colocados de volta no vídeo EEG. Durante o período entre ligadura e início da hipóxia, um subconjunto de camundongos exibe convulsões convulsivas (Figura 1A-C).
Após a indução de hipóxia, a amplitude de fundo no EEG reduziu (Figura 3B) e apresentou intermitentemente rajadas de descargas de ondas de pico, seguidas pela supressão (Figura 2A). Os camundongos exibem convulsões eletrográficas, que emergem de um fundo suprimido como descargas rítmicas de ondas de pico e progresso para se tornarem mais complexas e frequentes, com ondas de polispique (Figura 2B). Durante a hipóxia, a análise do espectrograma de energia foi notável para assimemetrias entre o hemisfério isquêmico e contralateral (Figura 3A,B). O hemisfério isquêmico apresentou um padrão de supressão de explosão e o hemisfério contralateral exibiu fundo suprimido (Figura 1A e Figura 3A,B). Em média, as convulsões começam 5,5±8,1 minutos após a indução de hipóxia, com cada evento durando 56±57 segundos. Houve uma taxa de mortalidade de 13% durante a hipóxia (n=4/30), com todos os óbitos após convulsão (BSS=5-6).
Durante a reoxigenação e recuperação, um subconjunto de camundongos continua a ter convulsões durante o restante do período de gravação (2 h pós-hipóxia). O fundo EEG foi suprimido em comparação com a linha de base após a hipóxia (Figura 1A e Figura 3), com recuperação gradual durante o período de registro pós-hipóxia. Durante todo o período de gravação, os camundongos apresentaram, em média, 9±5 eventos de convulsão, cada um com duração de 54±57,7 s.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61346/61346fig1v2.jpg"> Figura 1: Características de convulsão em camundongos p10 expostos à hipoxia neonatal-isquemia. (A) Espectrograma de energia representativo do eletrodo do córtex parietal isquêmico através da linha do tempo experimental. (Escala de mapa de calor de amplitude x10-6). Setas indicam o tempo que os rastreamentos de eletroencefalograma bruto abaixo do espectrograma representam. (B) Comportamentos de convulsão durante todo o experimento, pós-disquemia/prehipoxia, durante a hipóxia e pós-hipóxia. (C) Pontuação de convulsão comportamental (BSS) e tempo para todos os eventos de convulsão (n = 30 ratos, cada rato tem um símbolo único, cada ponto é um evento de convulsão discreto). 100% dos camundongos apreendidos durante a hipóxia (caixa azul; tempo = −60 minutos é a conclusão da ligadura carótida, tempo=0 é o início da hipóxia). Treze por cento morreram durante a hipóxia após uma convulsão (grau 5-6). Este número foi modificado de Burnsed et al13. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61346/61346fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61346/61346fig2v2.jpg"> Figura 2: Padrões característicos de eletroencefalografia (EEG) durante a isquemia de hipóxia. (A) Fundo de EEG da esquerda para a direita: linha de base pré-lesão, supressão de explosão durante a hipóxia, supressão pós-hipóxia. Gravação do eletrodo de profundidade do córtex parietal ipsilateral. (B) Evolução de uma convulsão durante a hipóxia. Gravação do eletrodo de profundidade hipocampal ipsilateral. As caixas sombreadas (I-V) corresponderam a trechos de EEG expandidos à direita de (B). Este número foi modificado de Burnsed et al13. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61346/61346fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="bigfig" src="/files/ftp_upload/61346/61346fig03.jpg"> Figura 3: Assimemetrias em fundo EEG entre hemisférios isquêmicos e contralaterais. (A) Espectrograma de potência assimétrica em camundongos HI durante a hipóxia (período de 45 minutos) no córtex isquêmico (esquerda) e córtex contralateral (à direita; escala de amplitude x10-6). Padrão de supressão de explosão e convulsões no hemisfério isquêmico, supressão no hemisfério CL. (B) Supressão de fundo durante a hipóxia e reoxigenação nos hemisférios IL e CL. Todas as medidas de tensão média tiradas de trechos aleatórios de 10 segundos do encefalograma durante o período de tempo experimental (linha de base, 30 minutos de pós-casamento, durante a hipóxia — 15 minutos e 30 minutos após o início, após a reoxigenação — 15 minutos e 60 minutos após o início) foram comparadas à linha de base. A linha de base de cada animal serviu como seu próprio controle, e os dados são relatados como uma porcentagem da linha de base (n = 5 ratos). As medidas foram tomadas a partir de eletrodos corticais. Este número foi modificado de Burnsed et al13. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61346/61346fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Este manuscrito descreve um método para gravações contínuas de EEG de vídeo usando eletrodos de profundidade múltiplos em camundongos neonatais submetidos à hipoxia-isquemia.

Eletroencefalograma de vídeo contínuo durante hipoxia-isquemia em camundongos neonatais

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...

continuous-video-electroencephalogram-during-hypoxia-ischemia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.3K visualizações.  University of Virginia. Este manuscrito descreve um método para gravações contínuas de EEG de vídeo usando eletrodos de profundidade múltiplos em camundongos neonatais submetidos à hipoxia-isquemia.

Vídeo: Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Video-oculography in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).
Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system5. Second, the oculomotor system is relative simple6; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles7. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis8. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes9.
Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels10. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice8.

Video-oculography is a very quantitative method to investigate ocular motor performance as well as motor learning. Here, we describe how to measure video-oculography in mice. Applying this technique on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors.

Vídeo oculografia-in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the ...

Neurociência

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Eletroporação Zona Neonatal subventricular

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

Neonatal Pial Superfície Eletroporação

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Vídeo Imagem e Mapas espaço-temporais para analisar Motilidade Gastrointestinal em Ratos

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such as epilepsy and neurodegenerative disorders. However, it is technically difficult to obtain EEG recordings in neonates as it requires specialized handling and great care. Here, we present a novel method to record EEG in neonatal rat pups (P8-P15). We designed a simple and reliable electrode using computer pin loci; it can be easily implanted into the skull of a rat pup to record high-quality EEG signals in the normal and epileptic brain. Pups were given an intraperitoneal (i.p.) injection of the neurotoxin kainic acid (KA) to induce epileptic seizures. The surgical implantation performed in this procedure is less expensive than other EEG procedures for neonates. This method allows one to record high-quality and stable EEG signals for more than 1 week. Furthermore, this procedure can also be applied to adult rats and mice to study epilepsy or other neurological disorders.

Here, we introduce a novel technique designed to record electroencephalography (EEG) in freely moving neonatal epileptic pups and describe its procedures, features, and applications. This method allows one to record EEG for more than 1 week.

Gravação de EEG em Ratos Neonatais de Movimentação Livre Usando um Novo Método

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...