我々は、次の資金源を認める: NIH NINDS – K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), バージニア大学医学部 (JB).

すべての動物研究は、バージニア大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 電極建物/ケーブルビルディング
<ol><li>単極絶縁ステンレス鋼線(0.005"裸径0.008"被覆)を使用して、メスソケットコネクタ(メスレセプタクルコネクタ0.079)で接続された電極を作ります。</li>
	<li>特別なカスタムケーブルを使用して、動物をアンプに接続します。<ol>
<li>オスの4ピンコネクタ(オスコネクタ0.079")を4チャンネルユニティゲインインピーダンスマッチングオペアンプ(op-amp)に取り付けます。9 V バッテリに接続するワイヤに 10K の抵抗を接続します。オペアンプに接続されていないアース線は、バッテリーの中点として機能します。</li>
		<li>ケーブルの一方の端(AWG、0.012"OD)をop-ampに接続し、ケーブルのもう一方の端をアンプに接続します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 電極注入手術
<ol><li>下向きのフローフードで4-5%のイオブルランで子犬(出生後9日目)を麻酔します。手順の開始前に、ブピバカイン(0.02-0.05 mL、0.25%皮下局所浸潤)で子犬を注入する。</li>
	<li>動物が不動になったら、鼻コーンで立体的な段階に移します。耳をしっかり止めるには柔らかいので、イヤーバーの裏側を使用します。この年齢では、子犬は耳棒の尖った端を使用するために完全に発達した耳を持っていません。</li>
	<li>イオフルランの流れを下げ、2.5~3%に維持します。手術を通して子犬の安定した呼吸に目を光らせる。尾をつまんで痛みの反応を確認し、切開に進みます。</li>
	<li>頭蓋骨の切開領域をベタジンとアルコール(ヨウ素と70%エタノールの3サイクル交互)で殺菌する。切開領域が見えるように周囲の身体部分をドレープする。</li>
	<li>目の上から頭皮前部後部を開き、約0.5cmの皮膚を引き込みます。皮膚が頭蓋骨を露出して外側に引っ張るように、ステレオタックスステージ上でマウスの頭を再配置します。</li>
	<li>綿棒を使用して頭蓋骨に過酸化水素を塗布し、メスの刃を使用して頭蓋骨をきれいに削ります。頭蓋骨は非常に柔らかいです。擦り傷をしながら注意を払ってください。</li>
	<li>接着剤を1滴(約50μL)塗布し、そのアプリケータを使用して露出した頭蓋骨領域の周りに広げます。40sの紫外線に露出して接着剤をセットします。</li>
	<li>参照として、露出したブレグマを使用して座標を測定します。海馬のCA1領域に両側電極を移植する [-3.5 mm側側腹孔(DV),±2mm内側側面(ML)、-1.75mm深部(D)、頭頂皮質内の両側[-1.22mm DV、±0.5mm D]および小脳内の参照電極。32G針を使用して、マークされた領域に穴を開けます。</li>
	<li>頭蓋骨の表面から血液をきれいにします。立体的な腕の助けを借りて脳に女性のソケットコネクタに取り付けられた下の電極と歯科アクリルで所定の位置に固定します。脳に電極を埋め込む。ソケットコネクタヘッドセットは、歯科アクリルで接着頭蓋骨の上に座っています。</li>
	<li>電極が固定されたら、ケトプロフェン(5mg/kg)を皮間領域に皮下に注入します。子犬を母親と一緒に戻します。 注:一度に1つずつ導入するのではなく、一度にヘッドセットでゴミの半分を導入してください。これは、母親が子犬のヘッドセットを損傷するのを防ぎます。</li>
</ol>3. EEGのセットアップと記録(ベースライン/プレ傷害)
<ol><li>電極注入後24時間の回収後、各動物をEEG記録用の加熱(37°C)カスタムメイドのプレキシグラスチャンバーに入れます。このチャンバーは低酸素室としても機能します。</li>
	<li>柔軟なケーブル(カスタムメイドのオペアンプケーブル)を介してビデオ-EEG監視システムにチャンバー内の子犬を接続します。 メモ:ヘッドセットを設置すると、マウスは自由に移動可能で、動作に違いはありません。電極ワイヤーに取り付けられたら、ワイヤーは、子犬がチャンバー全体を自由に移動できるように、適切な量の緩みを提供するためにチャンバーテザー内で調整する必要があります。</li>
	<li>草のアンプを使用して1Kゲインで1000 HzでEEGデータをデジタル化します。ソフトウェア(例えば、LabChart Pro)を使用して、後でEEG信号(3〜70 Hzの間のバンドパスフィルタ)を確認してください。</li>
	<li>頸動脈結紮術のために動物を切断する前に、傷害前のベースラインEEGを30分間記録する。</li>
</ol>4. 左頸動脈結紮
<ol><li>下向きのフローフードで4-5%のイオブルランで子犬(出生後10日目)を麻酔し、ウォーターバスパッドに特別に配置されたセットアップに置きます。動物のスピージンを配置し、紙テープで前肢を固定します。<ol>
<li>イオブルランの流れを2~3%に下げる。痛みの反応のために尾をつまみ、手順全体の呼吸を監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ベタジンとアルコール(ヨウ素と70%エタノールの3サイクル)で首の左側の切開領域(下顎骨と鎖骨の間)を殺菌します。</li>
	<li>マイクロシザーを使用して、首の左側に約1cmの長さの切開を行います。解剖顕微鏡を用いて、皮下組織と皮膚を慎重に引き込み、頸動脈を露出させる。迷走神経(動脈に横向きに走る)を特定し、動脈から繊細に分離して引き込むのに注意してください。</li>
	<li>マイクロ鉗子を使用して動脈の下に長さ5cmの無菌シルク縫合糸を通す。動脈の周りに二重結び目の縫合糸を結んで、閉塞流れにします。</li>
	<li>余分な縫合糸をカットし、皮下組織と皮膚を引き戻すことによって露出した動脈を閉じます.切開を密封するために獣医の結合を使用してください。</li>
	<li>動物を温かいマットレスの上に置かれる室温の部屋の連続的なEEGの監視に戻す。チャンバーを開けないように、子犬のコア温度のスポット赤外線温度チェックを取ります。動物が低酸素症の前に1時間回復することを許可します。</li>
</ol>5. EEGと低酸素症
<ol><li>酸素モニターを介してチャンバー内のFiO2 (インスパイアされた酸素の一部)を継続的に監視します。</li>
	<li>100%N2 の60 L/minと100%O2のための0.415 L /分でチャンバーを洗い流す。チャンバーの酸素飽和度が12%に達したら、O2の流れを変えずにN2 の流れを10 L/分に減らします。小さな調整で、45分間8%でFiO2 を維持します。</li>
	<li>低酸素暴露の45分後、21%にFiO2 を戻す。</li>
	<li>子犬はチャンバーで回復し、2時間ポスト低酸素症のEEG上で監視しています。</li>
	<li>記録期間終了後、マウスをEEG記録から切り離し、母親に戻します。</li>
</ol>6. EEG分析
<ol><li>ラボチャートプロのビデオでEEGファイルを分析します。目の不自由な研究者に発作と背景パターンのEEGをマークしてもらいます17。発作は、高周波のリズミカルな鋭波放電(≥3xベースライン)を持つ10秒以上続く電写イベントと定義され、明確な進化17を有する。</li>
	<li>2番目の盲目の研究者レビューは、合意のためにランダムにマークされたイベントを持っています。</li>
	<li>マークされた各電気イベントの関連ビデオをレビューし、新生児げっ歯類行動発作スコア16に従って分析する。簡単に言えば、このスコアは0-6(不動から重度の強壮性クロニック挙動)の範囲です。発作セミオロジーをさらに特徴付けるには、横性(多焦点/二国間運動対焦点/一方的な混合)の行動を分析する。</li>
	<li>パワースペクトログラムを作成します。1024 データ ポイントのサイズを持つコサイン ベル データ ウィンドウを使用して高速フーリエ変換を使用します。87.5%のウィンドウオーバーラップの助けを借りてスペクトログラムに滑らかなX軸を作成します。電源をμV218として表現します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vasudevan, C., Levene, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+aetiology+of+neonatal+seizures.">Epidemiology and aetiology of neonatal seizures.</a> Seminars in Fetal &amp; Neonatal Medicine. , (2013).</li><li>Volpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Seizures.">Neonatal Seizures.</a> Volpe's Neurology of the Newborn. , 275-321 (2018).</li><li>Shankaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+EKSNNR.+Childhood+outcomes+after+hypothermia+for+neonatal+encephalopathy.">Network EKSNNR. Childhood outcomes after hypothermia for neonatal encephalopathy.</a> New England Journal of Medicine. 366 (22), 2085-2092 (2012).</li><li>Pappas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+outcomes+after+neonatal+encephalopathy.">Cognitive outcomes after neonatal encephalopathy.</a> Pediatrics. 135 (3), 624-634 (2015).</li><li>van Schie, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+motor+and+behavioral+outcome+after+perinatal+hypoxic-ischemic+encephalopathy.">Long-term motor and behavioral outcome after perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy.</a> European Journal of Paediatric Neurology. 19 (3), 354-359 (2015).</li><li>Rensing, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+analysis+of+developmental+changes+in+electroencephalography+patterns+and+sleep-wake+states+of+the+neonatal+mouse.">Longitudinal analysis of developmental changes in electroencephalography patterns and sleep-wake states of the neonatal mouse.</a> PLoS One. 13 (11), 1-17 (2018).</li><li>Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+immaturity+on+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+rat.">The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat.</a> Annals of Neurology. 9 (2), 131-141 (1981).</li><li>Burnsed, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-ischemia+and+therapeutic+hypothermia+in+the+neonatal+mouse+brain--a+longitudinal+study.">Hypoxia-ischemia and therapeutic hypothermia in the neonatal mouse brain--a longitudinal study.</a> PLoS One. 10 (3), 0118889 (2015).</li><li>Semple, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+development+in+rodents+and+humans:+Identifying+benchmarks+of+maturation+and+vulnerability+to+injury+across+species.">Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species.</a> Progress in Neurobiology. , 1-16 (2013).</li><li>Comi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gabapentin+neuroprotection+and+seizure+suppression+in+immature+mouse+brain+ischemia.">Gabapentin neuroprotection and seizure suppression in immature mouse brain ischemia.</a> Pediatric Research. 64 (1), 81-85 (2008).</li><li>Comi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse.">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric Neurology. 31 (4), 254-257 (2004).</li><li>Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Electroencephalographic+Monitoring+with+Radio-Telemetry+in+a+Rat+Model+of+Perinatal+Hypoxia-Ischemia+Reveals+Progressive+Post-Stroke+Epilepsy.">Continuous Electroencephalographic Monitoring with Radio-Telemetry in a Rat Model of Perinatal Hypoxia-Ischemia Reveals Progressive Post-Stroke Epilepsy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (1), 404-415 (2010).</li><li>Burnsed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Circuit+Activity+during+Neonatal+Hypoxic+-+Ischemic+Seizures+in+Mice.">Neuronal Circuit Activity during Neonatal Hypoxic - Ischemic Seizures in Mice.</a> Annals of Neurology. 86, 927-938 (2019).</li><li>Sampath, D., White, A. M., Raol, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neonatal+seizures+in+an+animal+model+of+hypoxic-ischemic+encephalopathy.">Characterization of neonatal seizures in an animal model of hypoxic-ischemic encephalopathy.</a> Epilepsia. 55 (7), 985-993 (2014).</li><li>Sampath, D., Valdez, R., White, A. M., Raol, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticonvulsant+effect+of+flupirtine+in+an+animal+model+of+neonatal+hypoxic-ischemic+encephalopathy.">Anticonvulsant effect of flupirtine in an animal model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.</a> Neuropharmacology. 123, 126-135 (2017).</li><li>Kang, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+sex-dependent+susceptibility+to+phenobarbital-resistant+neonatal+seizures:+role+of+chloride+co-transporters.">and sex-dependent susceptibility to phenobarbital-resistant neonatal seizures: role of chloride co-transporters.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-16 (2015).</li><li>Zanelli, S., Goodkin, H. P., Kowalski, S., Kapur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+transient+acute+hypoxia+on+the+developing+mouse+EEG.">Impact of transient acute hypoxia on the developing mouse EEG.</a> Neurobiology of Disease. 68, 37-46 (2014).</li><li>Lewczuk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EEG+and+behavior+patterns+during+experimental+status+epilepticus.">EEG and behavior patterns during experimental status epilepticus.</a> Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2017).</li><li>Wu, D., Martin, L. J., Northington, F. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+gradient+diffusion+MRI+reveals+unique+microstructural+information+in+normal+and+hypoxia-ischemia+injured+mouse+brains.">Oscillating gradient diffusion MRI reveals unique microstructural information in normal and hypoxia-ischemia injured mouse brains.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1366-1374 (2014).</li></ol>

我々は、低酸素虚血発作の間に新生児マウスにおける連続的なビデオ-脳細胞モニタリングのためのモデルを提示した。EEGと連動したビデオ分析により、発作セミロジーの特徴付けが可能になります。EEGの分析は、パワースペクトログラムの抽出とバックグラウンド振幅分析を可能にします。
電極の配置中または不正確な配置時の損傷は結果に大きな影響を与える可能性がありますので、電極の正しく、慎重な配置は、このプロトコルで重要です。損傷前の正常なベースライン脳G活性の評価は、電極配置中の出血または傷害として最も重要であるが、まれに起こり得る。第二に、正しい電極配置を確認するために、脳を適切な配置で電極トラックについて切り離し、検査することができる。さらに、グループ(個別)で母親に子犬を返さないと、電極ヘッドセットが損傷したり、母親によって子犬が殺されたり無視されたりする可能性があります。
この方法の1つの制限は、小さな新生児脳における深度電極記録の空間的局在化の限界である。これは、EEGの記録に特定の発作病巣を局的にする能力を制限します。低酸素虚血のこのモデルのもう一つの制限は、発作負担の変動である。低酸素虚血のこのげっ歯類モデルにおける病変サイズおよび行動障害の変動性は、以前7,8,19に十分に記載されている。当然のことながら、この変動は発作の負担(発作事象の長さおよび発作事象の数の両方)に存在する。しかし、一貫して、このモデルの100%の子犬は低酸素症の間に発作を示す。最後に、子犬がEEGモニタリング(母親から離れている)にすることができる時間の量は限られています。したがって、我々は、怪我に関連して、後で継続的なEEGポイントで進行中の発作を特徴付けることができません。
この原稿では低酸素虚血発作モデルを用いたが、新生児マウスの子犬における連続的なビデオ-EEGモニタリングのためのこの方法は、他の疾患/発作モデルに容易に適用できる。新生児げっ歯類の発作は、単独で行動に基づいて認識することが困難であり、ビデオEEGモニタリングが重要です。今後の調査は、これらの技術を使用して、他の新生児発作モデルにおける発作負担と血管質学、または治療および神経保護措置への応答を分析する可能性がある。

低酸素性虚血性脳症(HIE)は、新生児1000人に1.5人の新生児に影響を及ぼし、新生児発作の最も一般的な原因である1,2である。生き残った乳児は、脳性麻痺、知的障害、てんかん3,4,5などの様々な神経障害の危険にさらされています。
動物モデルは、低酸素虚血および新生児発作の病態生理を理解し、調査する上で重要な役割を果たす6,7。修飾されたヴァンヌッチモデルは、出生後10日目(p10)7,8に低酸素虚血(HI)を誘導するために使用される。この年齢のマウスの子犬は、人間の新生児の完全な用語に神経学的に大まかに変換します 9.
この傷害モデルと組み合わせて使用される連続ビデオ脳波(EEG)モニタリングは、新生児低酸素虚血性発作のさらなる理解と特徴付けを可能にする。これまでの研究では、ビデオ録画、限られたEEG記録、テレメトリEEG記録10、11、12、13、14、15、16など、げっ歯類の新生児発作を分析するための様々な方法を使用してきました。以下の原稿では、低酸素虚血中のマウスの子犬に連続したビデオEEGを記録する過程について詳しく述べる。新生児マウスの子犬における連続的なビデオEEGモニタリングのためのこの技術は、様々な疾患および発作モデルに適用することができる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ball Point Applicator</td>
			<td>Metrex Research</td>
			<td>8300-F</td>
			<td>i-bond applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cranioplast (Powder/Resin)</td>
			<td>Coltene</td>
			<td>H00383</td>
			<td>Perm Reline/Power</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Bond</td>
			<td>Kulzer GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOOK Silk Suture</td>
			<td>Surgical Specialities Corporation</td>
			<td>SP115</td>
			<td>LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS-5168 Botvin Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS5168</td>
			<td>Forcep for surgery/ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS-5138 Graefe Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS5138</td>
			<td>Forcep for surgery/ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light for I-Bond</td>
			<td>Blast Lite By First Media</td>
			<td>BL778</td>
			<td>UV ligth for I-bond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Microdissecting Scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS5618</td>
			<td>Scissor for ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Bond</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>Vet Glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYPOXIA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxidial</td>
			<td>Starr Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen sensor</td>
			<td>Medical Products</td>
			<td></td>
			<td>MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EEG RECORDING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female receptacle connector 0.079&#34;</td>
			<td>Mill-Max Manufacturing Corp</td>
			<td>832-10-024-10-001000</td>
			<td>Ordered from Digikey</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grass Amplifier</td>
			<td>Natus Neurology Incorporated</td>
			<td></td>
			<td>Grass Product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart Pro</td>
			<td>ADI Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software to run the system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Socket Connector 0.079&#34;</td>
			<td>Mill-Max Manufacturing Corp</td>
			<td>833-43-024-20-001000</td>
			<td>Ordered from Digikey</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational Amplifier</td>
			<td>Texas Instruments, Dallas, TX, USA</td>
			<td>TLC2274CD</td>
			<td>TLC2274 Quad Low&#8208;Noise Rail&#8208;to Rail Operational Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operational Amplifier</td>
			<td>Texas Instruments, Dallas, TX, USA</td>
			<td>TLC2272ACDR</td>
			<td>TLC2274 Quad Low&#8208;Noise Rail&#8208;to Rail Operational Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel wire</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>791400</td>
			<td>0.005&#34; Bare/0.008&#34; Coated 100 ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Flexible Wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9564T1</td>
			<td>36 Gauze wire of various color</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous video electroencephalogram during hypoxia-ischemia in neonatal mice

低酸素虚血は新生児発作の最も一般的な原因である。動物モデルは、新生児発作や低酸素虚血の根底にあるメカニズムと生理学を理解するために重要です。本稿では、新生児マウスにおける連続的な脳波(脳波)モニタリングを行い、低酸素虚血中の脳波背景を解析する方法を説明する。ビデオとEEGを併用すると、発作のセミオロジーの記述と発作の確認が可能になります。この方法は、実験期間におけるパワースペクトログラムおよびEEG背景パターンの傾向を分析することも可能である。この低酸素虚血モデルでは、この方法は、損傷前のEEG記録が規範的ベースラインを得ることを可能にし、傷害および回復の間に。総モニタリング時間は、4時間以上母親から子犬を分離できないことによって制限されます。この原稿では低酸素虚血性発作のモデルを用いてきたが、新生児ビデオ脳Gモニタリングのこの方法は、げっ歯類の多様な疾患および発作モデルに適用することができる。

発作セミロジー
新生児低酸素-虚血曝露は、マウスの全身発作と焦点発作の両方をもたらす(図1A-C)。ビデオ脳波録画により、電解調査結果をビデオの動作と相関させます。これらの行動は、以前に公表された新生児げっ歯類行動発作スコア(BSS)16を用いて採点された。BSS に加えて、行動が焦点/一方的、二国間、または混合であるかに基づいてイベントを分類しました(図 1B)。
このモデルでは、マウスは一般的に3パターンの発作セミオロジーを示した:1)対側の四肢の延長を伴う結紮の側に繰り返し回る、2)身体屈曲と尾を結ぶ姿勢の喪失、または3)四肢の一方的または両側のパドリング(様々な重症度および長さ)で姿勢の喪失(様々な重症度および長さ)。観察されたイベントの大半は、焦点/一方的または混合行動を伴う(図1B)。さらに、低酸素期の間に、マウスのサブセットは、EEG上で持続的な発作活性を有する子犬が不動であった非痙攣発作活性を示した(図1C)。
電図録音
EEG記録は、頚動脈結紮の30分前に開始し、傷害前のベースラインを得るために開始した。ベースライン活性(図1Aおよび図2A)は、p10マウスpups17における前述の背景と類似していた。ライゲーションの後、子犬はすぐにビデオEEGに戻されました。低酸素症の結紮と開始の間に、マウスのサブセットは痙攣性発作を示す(図1A-C)。
低酸素誘導後、EEGのバックグラウンド振幅が低下し(図3B)、スパイク波放電のバーストが断続的に発生し、続いて抑制が行われた(図2A)。マウスは、リズミカルなスパイク波放電として抑制された背景から出現し、ポリスパイク波でより複雑で頻繁に進行する電解発作を示す(図2B)。低酸素症の間、パワースペクトログラム分析は虚血性と対側半球の非対称性に顕著であった(図3A、B)。虚血性半球はバースト抑制パターンを示し、対側半球は抑制された背景を示した(図1A および 図3A、B)。平均発作は低酸素症の誘導後5.5±8.1分で始まり、各事象は56±57秒間続く。低酸素症(n=4/30)の間に13%の死亡率があり、痙攣(BSS=5-6)発作後のすべての死亡があった。
再酸素化および回復の間、マウスのサブセットは、記録期間の残りの期間にわたって発作を起こし続ける(2時間後低酸素症)。低酸素症に続くベースライン(図1A および 図3)に比べ、EEG背景は抑制され、低酸素後の記録期間中は緩やかに回復した。全体の記録期間中、マウスは平均9±5の発作イベントを示し、それぞれ54±57.7s続いた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61346/61346fig1v2.jpg"> 図1:新生児低酸素-虚血に曝露したp10マウスにおける発作特性 (a)実験タイムラインを介して虚血性頭頂皮質電極からの代表的なパワースペクトログラム。(振幅カラーヒートマップスケールx10–6)。矢印は、スペクトログラムの下にある生の脳波トレースが表す時間を示します。(B)実験全体、心血症/前低酸素症、低酸素症、および低低酸素症の発作行動。(C)行動発作スコア(BSS)及び全ての発作イベント(n=30マウス、各マウスは固有のシンボルを有し、各点は離散発作イベント)のタイミングを有する。低酸素症の間に押収されたマウスの100%(青いボックス;時間=−60分は頸動脈結紮の完了、時間=0は低酸素症の始まり)である。痙攣発作(グレード5~6)の後、低酸素症の間に13%が死亡した。この図は、バーンズら13から変更されています。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61346/61346fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61346/61346fig2v2.jpg"> 図2:低酸素虚血中の特徴的な脳波(EEG)パターン。 (A) 左から右へのEEG背景:傷害前ベースライン、低酸素症中のバースト抑制、低酸素症後抑制。イプシアショナル頭頂皮質深度電極からの記録。(B) 低酸素症における発作の進化海馬深度電極から記録。シェーディングボックス(I-V)は、(B)の右側にある拡張されたEEG抜粋に対応した。この図は、バーンズら13から変更されています。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61346/61346fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="bigfig" src="/files/ftp_upload/61346/61346fig03.jpg"> 図3:虚血性半球と対角半球の脳脳の背景における非対称性 (A) 虚血性皮質(左)と対側皮質(右;振幅スケールx10-6)の低酸素(45分期間)中のHIマウスの非対称パワースペクトログラム。虚血性半球におけるバースト抑制パターン及び発作、CL半球における抑制。(B) ILおよびCL半球における低酸素および再酸素化中のバックグラウンド抑制。実験期間における脳科学の10秒ランダムな抜粋(ベースライン、30分後合分、低酸素期(開始後15分30分、再酸素化後15分と60分)から得られた平均電圧の全ての測定値をベースラインと比較した。各動物のベースラインは独自のコントロールとして働き、データはベースライン(n=5匹のマウス)の割合として報告される。測定は皮質電極から採取した。この図は、バーンズら13から変更されています。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61346/61346fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

本稿では、低酸素虚血を起こす新生児マウスにおける複数の深度電極を用いた連続的なビデオEEG記録の方法を説明する。

新生児マウスにおける低酸素虚血期における連続映像脳波

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...

continuous-video-electroencephalogram-during-hypoxia-ischemia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.3K ビュー.  University of Virginia. 本稿では、低酸素虚血を起こす新生児マウスにおける複数の深度電極を用いた連続的なビデオEEG記録の方法を説明する。

ビデオ: Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Video-oculography in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).
Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system5. Second, the oculomotor system is relative simple6; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles7. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis8. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes9.
Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels10. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice8.

Video-oculography is a very quantitative method to investigate ocular motor performance as well as motor learning. Here, we describe how to measure video-oculography in mice. Applying this technique on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors.

マウスのビデオ眼球運動記録法

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the ...

神経科学

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

新生児の脳室下帯のエレクトロ

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

新生児軟膜表面エレクトロ

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

マウスにおける低温感受性と適応を決定するためのシンプルで安価な方法

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

マウスにおける胃腸の運動を分析するためにビデオ画像と時空間マップ

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such as epilepsy and neurodegenerative disorders. However, it is technically difficult to obtain EEG recordings in neonates as it requires specialized handling and great care. Here, we present a novel method to record EEG in neonatal rat pups (P8-P15). We designed a simple and reliable electrode using computer pin loci; it can be easily implanted into the skull of a rat pup to record high-quality EEG signals in the normal and epileptic brain. Pups were given an intraperitoneal (i.p.) injection of the neurotoxin kainic acid (KA) to induce epileptic seizures. The surgical implantation performed in this procedure is less expensive than other EEG procedures for neonates. This method allows one to record high-quality and stable EEG signals for more than 1 week. Furthermore, this procedure can also be applied to adult rats and mice to study epilepsy or other neurological disorders.

Here, we introduce a novel technique designed to record electroencephalography (EEG) in freely moving neonatal epileptic pups and describe its procedures, features, and applications. This method allows one to record EEG for more than 1 week.

新しい方法を用いた自由に動く新生児ラットの脳波記録

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...