Este trabalho foi apoiado por um subsídio de doutorado do IMPRS à E.S, uma Bolsa de Longo Prazo da EMBO para v.P., e fundos internos do MPI-MPP para f.K. Parte deste trabalho também foi financiado através do PLAMORF, um projeto que recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) sob o programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia (Grant Agreement No. Os autores gostariam de agradecer a Federico Apelt pela análise bioinformática e comentários sobre o manuscrito, e Mathieu Bahin e Amira Kramdi pela análise bioinformática.

1. Preparando o RNA
<ol><li>Triture 200 mg de tecido vegetal em pó em nitrogênio líquido, certificando-se de que o tecido permaneça congelado durante todo o procedimento.</li>
	<li>Extrair o RNA do tecido vegetal desejado seguindo um protocolo de extração de tiocianato-cloronato ácido guanidinium-phenol-clorofórmio. Para diminuir a possibilidade de contaminar o RNA com DNA durante a separação de fase, use 1-bromo-3-cloropropano em vez de clorofórmio.<ol>
<li>Adicione 1 mL de reagente de extração de RNA contendo tiocianato de guanidina e fenol ácido ao tecido vegetal moído (500 μL por tecido de 100 mgs). Misture bem invertendo e certifique-se de que todo o tecido está molhado. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente para dissociar os complexos ribonucleoproteínos.</li>
		<li>Centrifugar por 10 min a 12.000 x g a 4 °C e transferir o supernasal para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 200 μL de 1-bromo-3-cloropropano (100 μL por 500 μL reagente de extração de RNA) e vórtice vigorosamente.</li>
		<li>Centrifugar por 15 min a 12.000 x g a 4 °C e transferir a fase aquosa superior (aproximadamente 500 μL) para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 1 volume de isopropanol (500 μL) e 0,1 volume de acetato de sódio de 3 M pH 5,5 (50 μL), misture bem invertendo e precipitando 10 min a -20 °C. NOTA: Recomenda-se o uso de acetato de sódio (NaOAc) para aumentar a precipitação do RNA. O protocolo pode ser pausado neste momento prolongando a precipitação do RNA por algumas horas ou até mesmo durante a noite.</li>
		<li>Centrifugar por 30 min a 12.000 x g a 4 °C e descartar o supernaspe.</li>
		<li>Lave a pelota duas vezes com 500 μL de 80% EtOH, centrífuga por 5 min a 12.000 x g a 4 °C e descarte.</li>
		<li>Lave a pelota uma vez com 500 μL 99% EtOH, centrífuga por 5 min a 12.000 x g a 4 °C e descarte.</li>
		<li>Seque a pelota por 5-10 min e dissolva em 30 μL de H2O sem RNase. NOTA: Em vez disso, use qualquer protocolo de extração de RNA de escolha (por exemplo, um sistema baseado em colunas). Se uma digestão DNase estiver incluída no protocolo, pule-a na etapa seguinte (etapa 1.3).</li>
	</ol></li>
	<li>Meça a concentração de RNA (por exemplo, com o uso de um espectrofotômetro) e digerir 20 μg de RNA com DNase. NOTA: O DNA é rico em m5C e o anticorpo não distingue entre DNA e RNA.<ol>
<li>Em uma reação típica de DNase, trate 10 μg de RNA em uma reação de 50 μL. Misture os seguintes componentes e incubar a reação a 37 °C por 30 min: 10 μg de RNA x μL 10x Buffer DNase 5 μL DNase 1 μL (2 unidades) H2O sem rnase até 50 μL</li>
		<li>Remova a enzima adicionando um volume apropriado de reagente de inativação DNase (se estiver incluído no kit DNase e de acordo com as instruções do fabricante) ou realizando uma etapa de limpeza (por exemplo, purificação da coluna ou extração de fenol/clorofórmio).</li>
	</ol></li>
	<li>Verifique a qualidade e pureza do RNA isolado por eletroforese capilar e proceda se o número de integridade do RNA (RIN) for superior a 7, para garantir que as amostras sejam de boa qualidade.</li>
	<li>OPCIONAL: Remova o RNA ribossômico para enriquecer as amostras em conteúdo mRNA usando um kit de remoção de rRNA e de acordo com o protocolo do fabricante.<ol>
<li>Use o RNA tratado de DNase da etapa anterior para a reação de esgotamento do rRNA( s). Realize múltiplas reações se a quantidade de RNA total for superior à quantidade máxima sugerida para a reação.</li>
		<li>Observe que apenas 5-10% do valor de entrada será recuperado após o esgotamento do rRNA. Proceda com o RNA esgotado rRNA (quantidade igual para todas as amostras) e ignore os valores mencionados nas etapas seguintes, como se referem ao RNA total. NOTA: Para comparação e descrição dos métodos de esgotamento do rRNA disponíveis, consulte as referências 38,39,40. rRNA é a maior parte do RNA total e é m5C metilado em muitos organismos.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare com antecedência transcrições in vitro (IVT) para serem usadas como sequências de RNA de controle e adicione-as nas amostras.<ol>
<li>Produzir dois IVTs distintos usando um kit de transcrição in vitro, um com nucleosídeos não metilados e outro onde o rCTP é substituído por 5-metil-rCTP, para servir como controles negativos e positivos no MeRIP, respectivamente. As transcrições preparadas foram as da EGFP e renilla luciferase. NOTA: Os IVTs não devem existir no transcriptome do organismo que você está analisando. Se os IVTs forem do mesmo modelo (por exemplo, ambos EGFP), adicione o controle positivo e negativo em duas amostras diferentes. Se sua sequência for diferente (por exemplo, EGFP e Renilla), elas podem ser adicionadas à mesma amostra.</li>
		<li>Pico em cada amostra 0,1 ng IVT por 3 μg de RNA, como controles.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonicar o RNA para aproximadamente 100 fragmentos. NOTA: As condições para a cisalhamento de RNA devem ser ajustadas com antecedência e diferem para cada sonicator. Para o modelo utilizado aqui, a sônica é realizada com as seguintes condições: Pico de potência 174, Fator dever 10, Ciclos/estouro 200, 17 min.<ol>
<li>Sonicate a mesma quantidade de RNA para todas as amostras, pelo menos 12 μg RNA por amostra em 80 μL de volume total (min 60 μL, máximo 100 μL), preenchido com H2O sem RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirme a eficiência da sônica e a concentração das amostras de RNA por eletroforese capilar. O tamanho médio do RNA fragmentado deve ser de cerca de 100 nt.</li>
</ol>2. Imunoprecipitação de RNA metilada (MeRIP)
<ol><li>Em tubos de baixa ligação, adicione 9 μg de RNA sonicado e H2O sem RNase até 60 μL (ou mais, dependendo da concentração).</li>
	<li>Dissociar as estruturas secundárias aquecendo o RNA a 70 °C em um banho de água por 10 minutos e esfriando por mais 10 minutos em uma mistura de água gelada.</li>
	<li>Divida a amostra em três partes: um terço (20 μL, se 60 μL foram tomados na etapa 2.1) é salvo em um tubo separado a -80 °C como a amostra de entrada. Encha os 40 μL restantes com H2O sem RNase até 860 μL e depois divida em dois tubos de baixa ligação: um para IP e outro para o controle Mock (430 μL cada).</li>
	<li>Adicione aos dois tubos: 50 μL de tampão MeRIP 10x 10 μL do inibidor de RNase 10 μL de anticorpo α-m5C (10 μg) na amostra IP por 10 μL de H2O na amostra Mock NOTA: O clone de anticorpos usado anteriormente não está mais disponível comercialmente. No entanto, qualquer anticorpo monoclonal anti-5-metilcittosina deve funcionar da mesma forma. Os anticorpos devem ser testados para especificidade antes de utilizados para MeRIP11,23.</li>
	<li>Sele os tubos com parafilm e incubar por 12-14 horas a 4 °C, com rotação aérea.</li>
	<li>No dia seguinte, prepare as contas magnéticas da proteína G para a ligação.<ol>
<li>Para cada tubo (controle IP ou Mock), use 40 μL de contas. Adicione a quantidade total de contas (# de tubos x 40 μL, por exemplo, para 2 amostras de IP e 2 Simuladas, são necessários 160 μL de contas) em um tubo de 15 mL e lavar três vezes com 800 μL de 1x tampão MeRIP por amostra (# de tubos x 800 μL tampão, por exemplo, 3,2 mL para 2 amostras DE IP e 2 Simulações).</li>
		<li>Realizar lavagens em temperatura ambiente por 5 minutos com rotação aérea, coletar as contas com a ajuda de um rack magnético e descartar o tampão de lavagem. Após a terceira lavagem, resuspenque as contas no mesmo volume de 1x tampão MeRIP como o volume inicial de contas colhidas (# de tubos x 40 μL, por exemplo, 160 μL de 1x tampão MeRIP para 2 ip e 2 amostras simuladas). NOTA: A quantidade de proteínas G utilizadas é determinada pela capacidade de vinculação das contas para o tipo de anticorpo específico e a quantidade de anticorpos utilizados. Neste caso, as contas têm uma capacidade de ligação de aproximadamente 8 μg de IgG por mg de contas e concentração de 30 mg/mL. Portanto, 40 μL são suficientes para ligar aproximadamente 9,6 μg de anticorpo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 40 μL de contas resuspendadas a cada amostra IP e Mock e incubar por 2 horas adicionais a 4 °C, com rotação aérea.</li>
	<li>Coloque os tubos em um rack magnético por 1 min e descarte o supernatante ou salve-o como um controle (amostra de RNA não vinculada).</li>
	<li>Lave as contas 5 vezes por resuspending em 700 μL de 1x tampão MeRIP fornecido com 0,01% Tween 20 e incubação por 10 minutos em temperatura ambiente com rotação aérea.</li>
	<li>Resuspengue as contas lavadas em 200 μL de tampão de digestão Proteinase K e adicione 3,5 μL de Proteinase K. Incubar por 3 horas a 50 °C, tremendo a 800 rpm. Ocasionalmente, gire manualmente a parte inferior do tubo se um sedimento de contas estiver se formando durante a incubação.</li>
	<li>Extrair o RNA por adição de 800 μL de reagente de extração de RNA e seguindo um protocolo de extração de tiocianato-fenol-clorofórdo ácido de guanidinium, e continuar como na etapa 1.2. Para aumentar a visibilidade da pelota de RNA, um co-precipitante colorido pode ser adicionado em isopropanol na etapa de precipitação. Resuspenha a pelota em 20 μL de H2O sem RNase (ou igual ao volume de entrada mantido na etapa 2.3).</li>
</ol>3. Análise a jusante
<ol><li>Envie as amostras de Entrada e IP para sequência de extremidade única com 50 bases de comprimento de leitura (SE50).</li>
	<li>Corte os adaptadores finais de 3' usando cutadapt41 e descarte leituras mais curtas que 48 nt.</li>
	<li>Mapa aparado lê para o genoma arabidopsis (anotação TAIR10) usando STAR42 com um corte de 6% para incompatibilidades e tamanho máximo intron de 10 kb. Mantenha leituras exclusivamente mapeadas para análises posteriores.</li>
	<li>Identifique fragmentos de RNA enriquecidos em amostras de IP em comparação com a Entrada usando dois métodos distintos e considere aqueles que são encontrados significativamente enriquecidos por ambos.<ol>
<li>Primeiro, detecte picos de MeRIP-seq usando o pico MACS243 em IPs agrupados versus Entrada.</li>
		<li>Em segundo lugar, siga a análise para merip-seq peak chamada como descrito em Meyer et al.22 e Yang et al.17.<ol>
<li>Usando scripts R personalizados, divida o genoma em distintas janelas de 25 nt e conte o número de leituras mapeadas exclusivamente para cada janela com base na posição do último nucleotídeo mapeado (uma vez que as leituras se originam de fragmentos de RNA de 100 nt).</li>
			<li>Calcule janelas significativamente enriquecidas em amostras de IP em comparação com a entrada com o Teste Exato de Fisher. Use o procedimento Benjamini-Hochberg para corrigir para vários testes.</li>
			<li>Mantenha os picos significativamente enriquecidos que se estendem por pelo menos duas janelas consecutivas e descarte picos que cobrem apenas uma janela.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificar regiões anotadas do genoma (transcrições) com picos significativamente enriquecidos encontrados por ambos os métodos.</li>
	<li>Alternativamente ou complementarmente, teste metas específicas de RNA para seu enriquecimento nas amostras de IP.<ol>
<li>Transcreva inversa o RNA (mesmo volume de amostras de Entrada, IP e Mock) com hexamers aleatórios.</li>
		<li>Execute pcr quantitativo em tempo real nos alvos escolhidos, comparando Entrada, IP e Simulação através do método ΔΔCt. NOTA: O produto gerado não deve ser superior a 100 bp, pois este é o tamanho médio da fragmentação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.

O RNA carrega mais de cem modificações de base distintas4 que formam o epitranscriptome44. Essas modificações adicionam uma camada adicional de regulação da tradução e sinalização (revisada em5,6,8,20,45,46). Estudos iniciais foram capazes de detectar a presença de modificações pós-transcrição no RNA28,47, mas as RNAs modificadas específicas precisam ser identificadas para entender o papel da epitranscriptomia. O MeRIP foi projetado como um método para mapear os sites de metilação de RNA transcriptome-wide21,22. Pode ser adaptado a qualquer modificação, se um anticorpo específico estiver disponível.
A principal força deste protocolo é que é relativamente simples, seguro para o RNA e para o usuário (por exemplo, 5-azaC é altamente tóxico para plantas e seres humanos) e não requer sequência ou modificação de informações enzimáticas. Além disso, o enriquecimento de RNAs metiladas pelo PI aumenta as chances de baixa abundância de mRNAs serem detectados, ao contrário do sequenciamento de bisulfoto que não contém um passo de enriquecimento. Quando duas rodadas seriais de MeRIP são realizadas, o enriquecimento em fragmentos de RNA contendo locais de metilação aumenta ainda mais22. Uma das limitações do MeRIP, especialmente quando aplicado aos estudos de metilação de mRNA, é a alta quantidade de RNA necessária como insumo para o ensaio. A etapa de ribodepletion – ou poli(A) – reduzirá o fundo causado pelo RNA ribossômico fortemente modificado, mas remove mais de 90% do RNA total. O DNA também deve ser completamente removido, pois é rico em citosinas de 5 metilados. Outra desvantagem é a menor resolução da posição exata da metilação. A sônicação do RNA antes da incubação com o anticorpo ajuda nessa direção, reduzindo a região contendo a modificação para 100-200 nucleotídeos. Quando o MeRIP é combinado com sequenciamento profundo, a resolução da previsão do local m5C aumenta à medida que as leituras de sequenciamento formam uma distribuição gaussiana em torno do potencial local de metilação. Além disso, a especificidade do anticorpo precisa ser confirmada antes do ensaio (por exemplo, com ensaios de manchas de ponto RNA, realizadas com oligos sintetizados com nucleotídeos modificados), no entanto, até que ponto um anticorpo pode realmente distinguir entre modificações intimamente relacionadas (por exemplo, m6A e m6Am) é um ponto de discussão no campo48,49. Além disso, rnas altamente estruturadas podem interferir na interação anticorpo-antígeno, outra restrição que é abordada principalmente com fragmentação e desnaturação do RNA antes do PI. Pelo contrário, o sequenciamento de bisulfotos que também é afetado por estruturas secundárias, não inclui um passo de fragmentação e isso pode ser uma das razões que causa discrepância entre os locais m5C e mRNAs previstos pelo sequenciamento de bisulfoto16 e MeRIP-seq11,17. Outras modificações de citosina (por exemplo, hm5C) também são resistentes à deaminação mediada por bisulfato35.
As modificações do MeRIP-seq incluem uma etapa de crosslinking, seja com a introdução de um ribonucleoídeo fotoactivatable (foto-crosslinking assistido m6A-seq, PA-m6A-seq 50) ou usando luz UV para criar crosslinks anticorpo-RNA após o IP (miCLIP49, método diferente do miCLIP descrito introdução em30, mas também com resolução individual-nucleotide). No futuro, e à medida que o conhecimento sobre a metilação de RNA está se acumulando, abordagens mais direcionadas podem ser preferíveis, com base nas enzimas modificadoras e/ou nas sequências de consenso onde a metilação está aparecendo. A identificação de proteínas leitoras é essencial para a compreensão da função molecular e de sinalização das modificações pós-transcricionais. A tecnologia de sequenciamento de nanoporos já permite a identificação direta de nucleotídeos modificados sem tratamento prévio do RNA17, mas ainda há espaço para melhorias neste campo em relação à profundidade da sequência e à análise bioinformática. No geral, o MeRIP-seq é atualmente uma abordagem estabelecida, confiável e imparcial para identificar transcrições de RNA metiladas.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.

Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Em todos os três reinos da vida, as espécies de RNA sofrem modificações pós-transcricionais e pesquisas sobre essas modificações bioquímicas funcionalmente relevantes são chamadas de "epitranscriptomia". Epitranscriptomia é um campo em crescimento e vários métodos estão sendo desenvolvidos para estudar e mapear as modificações nas moléculas de RNA (revisadas em1,2). Mais de cem modificações de RNA foram encontradas, detectadas em rRNAs, tRNAs, outros ncRNAs, bem como mRNAs3,4. Embora a presença e a função de modificações pós-transcricionais quimicamente diversas em tRNAs e rRNAs sejam extensivamente estudadas5,6,7,8, apenas recentemente foram caracterizadas modificações de mRNA. Nas plantas, muitas modificações de mRNA foram identificadas até o momento, incluindo m7G na estrutura da tampa9, m1A10, hm5C11,12, e uridylation13. No entanto, apenas m6A10,14,15, m5C11,16,17, e pseudouridina18 foram mapeados em arabidopsis. Modificações de base mRNA pós-transcrição estão envolvidas em vários processos de desenvolvimento19,20.
Uma das abordagens mais utilizadas na epitranscriptomia é a imunoprecipitação de RNA metilada aliada ao sequenciamento profundo (MeRIP-seq). O MeRIP-seq foi desenvolvido em 2012 para estudar m6A em células de mamíferos21,22. Requer o uso de um anticorpo para a modificação desejada e visa enriquecer para fragmentos de RNA que carregam o nucleotídeo modificado.s. Geralmente é seguido por sequenciamento profundo para identificar e mapear os fragmentos enriquecidos ou PCR quantitativo para verificar alvos específicos de RNA. A precisão do MeRIP baseia-se na especificidade do anticorpo para reconhecer o nucleotídeo modificado sobre modificações semelhantes (por exemplo, m5C e hm5C11,23). Além do m6A, o MeRIP-seq também foi aplicado para estudar m1A e m5C RNA metilação em diversos organismos11,17,23,24,25.
A metilação da citosina na quinta posição de carbono (m5C) é a modificação de DNA mais prevalente26,27 e uma das modificações mais comuns do RNA também3,4. Enquanto o m5C foi detectado em mRNAs eucarióticos em 197528, só recentemente tem estudos focados no mapeamento da modificação transcriptome-wide, em codificação e não codificação RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.
Métodos alternativos utilizados na pesquisa m5C RNA incluem conversão química de citosinas não metiladas em uracils (sequenciamento de bisulfo) e ensaios de imunoprecipitação baseados em uma ligação irreversível de um conhecido RNA citosina metiltransferase aos seus alvos de RNA (miCLIP, aza-IP). Em breve, o sequenciamento de bisulfato explora a característica de citosina 5-metilada para ser resistente ao tratamento de bisulfito de sódio que desamina cistilha cistão para uracil. O método foi desenvolvido pela primeira vez para o DNA, mas adaptado para RNA também e muitos estudos optaram por essa abordagem para detectar m5C em RNA16,23,29,32,34,35. Tanto o miCLIP quanto o aza-IP exigem conhecimento prévio da metiltransferase de citosina RNA e uso do respectivo anticorpo. No caso do miCLIP (metilação individual-nucleotídeo-resolução crosslinking e imunoprecipitação), o metiltransferase carrega uma única mutação de aminoácidos de modo que se liga ao substrato de RNA, mas não pode ser liberado30. Em aza-IP (imunoprecipitação de RNA mediada 5-azacytidine), a ligação irreversível é formada entre o nucleosídeo 5-azac e o RNA citosina metiltransferase quando exogenou 5-azaC é incorporada por polimerases de RNA em uma molécula de RNAalvo 31.
A principal vantagem desses três métodos é que eles permitem o mapeamento da resolução de nucleotídeos únicos de m5C. Além disso, o miCLIP e o aza-IP fornecem informações sobre os alvos específicos de um metiltransferase de citosina RNA selecionada, decifrando mais profundamente o mecanismo e o papel das modificações pós-transcrição do RNA. No entanto, a abordagem MeRIP-seq pode identificar regiões transcriptome-wide m5C sem qualquer conhecimento prévio necessário e evita condições químicas e de temperatura severas, como tratamento de bisulfato ou incubação com 5-azaC. Tanto o sequenciamento de MeRIP quanto o bisullfita podem ser inibidos pelas estruturas secundárias de RNA36. A etapa de fragmentação incluída no ensaio merip antes da imunoprecipitação visa facilitar a ligação de anticorpos e aumentar a resolução da identificação m5C.
Outro método que vale a pena mencionar é a espectrometria de massa (MS) dos nucleosídeos de RNA. A ESM pode detectar e distinguir qualquer tipo de modificação tanto no DNA quanto no RNA. Resumidamente, o RNA é extraído e dNase digerido, depois desalado e digerido para nucleosídeos únicos. Os nucleosídeos de RNA são analisados por um espectrômetro de massa. Este método pode ser usado para quantificar os níveis de cada modificação e não depende de um anticorpo ou de uma conversão química. No entanto, uma grande desvantagem é que ele fornece informações em massa sobre a presença de modificações de RNA. Para mapear as modificações, a EM precisa ser combinada com informações de digestão e sequenciamento de RNase sobre moléculas específicas de RNA, como no caso do tRNALeuhumano(CAA)37.
Aqui, descrevemos e discutimos o ensaio MeRIP usado para estudar a metilação m5C RNA em Arabidopsis17.

<table><tbody><tr><td>anti-m&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;C antibody</td><td>ZymoResearch</td><td>A3001 (discontinued), A3002 available</td><td>Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available</td></tr><tr><td>Chip and reagents for capillary electrophoresis</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 6000 Nano kit</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td>TURBO DNA-free kit</td></tr><tr><td>Co-precipitant of nucleic acids</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>Glycoblue, 15 mg/mL</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vitro&lt;/em&gt; transcription kit</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System</td></tr><tr><td>Low-binding reaction tubes</td><td>Kisker Biotech</td><td>G017</td><td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Protein G magnetic beads</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dynabeads Protein G</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>20mg/mL stock solution, RNA grade</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>RNasin Plus 40 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>rRNA removal kit</td><td>Epicentre</td><td>RZPL11016</td><td>Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)</td></tr><tr><td>Sonication tubes</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td></tr><tr><td>RNA extraction reagent</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol reagent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillary electrophoresis machine</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>2100 Bioanalyzer System</td></tr><tr><td>Magnetic rack</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>discontinued</td><td>5417R model</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Benchmark</td><td>R4040</td><td>RotoBot Mini</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>S220 Focused-ultrasonicator</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>NanoDrop OneC</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1012</td><td>1012 Incubation bath</td></tr></tbody></table>

methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis

Modificações de base secundárias no RNA, como o m5C, afetam a estrutura e a função das moléculas modificadas de RNA. Imunoprecipitação e sequenciamento de RNA metilado (MeRIP-seq) é um método que visa enriquecer para RNA metilado e, finalmente, identificar transcrições modificadas. Brevemente, o RNA sonicado é incubado com um anticorpo para citosinas de 5 metilados e precipitado com a ajuda de contas G proteicas. Os fragmentos enriquecidos são então sequenciados e os potenciais locais de metilação são mapeados com base na distribuição das leituras e detecção de pico. O MeRIP pode ser aplicado a qualquer organismo, pois não requer nenhuma sequência prévia ou modificação do conhecimento enzimante. Além da fragmentação, o RNA não está sujeito a nenhum outro tratamento químico ou de temperatura. No entanto, o MeRIP-seq não fornece previsão de nucleotídeo único do local de metilação como outros métodos fazem, embora a área metilada possa ser reduzida a alguns nucleotídeos. O uso de diferentes anticorpos específicos de modificação permite que o MeRIP seja ajustado para as diferentes modificações de base presentes no RNA, ampliando as possíveis aplicações deste método.

Um esquema do método é fornecido na Figura 1. Os primeiros passos críticos do protocolo são obter RNA de boa qualidade (RIN ≥ 7) e sonicá-lo para aproximadamente 100 fragmentos nt. A eficiência de ambas as etapas é examinada por uma máquina de eletroforese capilar baseada em chip. Na Figura 2A, uma execução representativa de uma boa amostra de RNA é mostrada. A amostra é diluída 1:10 antes de carregar no chip, a fim de ter uma concentração que está na faixa de detecção do kit utilizado (5-500 ng/μL). A mesma amostra também é executada após a sônica e é mostrada na Figura 2B. Observe que a presença de um pico uniforme deslocado para a esquerda do diagrama, em um tamanho de cerca de 100 nucleotídeos. A menor concentração é causada tanto pela perda de RNA durante a fragmentação, como também pelo aumento do volume das amostras (60-100 μL, etapa 1.7.1).
A qualidade das amostras IP e Mock pode ser avaliada por qRT-PCR. Para isso, os IVTs cravados servem como controles positivos e negativos: o IVT metilado, onde em todas as posições de citosina há m5C, deverá ser altamente enriquecido na amostra de IP; pelo contrário, o IVT não metilado não deve ter diferença entre IP e Mock. Os primers utilizados no ensaio qRT-PCR para os dois IVTs de controle(EGFP e Renilla luciferase) estão listados na Tabela 1. De fato, como mostrado na Figura 3,cerca de 80% do IVT metilado foi recuperado na amostra de IP, e apenas aproximadamente 2% no Mock. Para o controle não metilado, a recuperação foi inferior a 1% em amostras de IP e Mock. Isso verifica a eficiência do MeRIP de que fragmentos de RNA metilado foram precipitados e enriquecidos, e é um bom indicador de que as amostras podem ser usadas para análise a jusante. Além disso, o enriquecimento da dobra do IVT não metilado (razão IP para Mock) pode ser aplicado como um limiar para estimar a significância do enriquecimento nos ensaios qRT-PCR.
Após o alinhamento das leituras ao genoma(Figura 4),os algoritmos de chamada de pico descritos nas etapas 3.4.1 e 3.4.2 são aplicados para identificar as janelas estatisticamente significativas, enriquecidas nas amostras de IP em comparação com a Entrada. As sequências que correspondem a essas janelas podem ser utilizadas ainda mais, por exemplo, para procurar motivos conservados relacionados à metilação11,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do protocolo MeRIP-seq. As amostras de RNA são incubadas com um anticorpo para citosinas de 5 metilados e os complexos são puxados para baixo com contas magnéticas G proteínas que capturam os anticorpos juntamente com o RNA ligado. As amostras de RNA elucidas são analisadas por sequenciamento profundo e qRT-PCR. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> Figura 2: Resultados representativos da análise da qualidade das amostras de RNA. (A) Perfil representativo de uma amostra total qualificada da planta RNA. (B) Perfil representativo de uma amostra de RNA após a sônica para fragmentos de 100 nt. Arquivos de saída do software de eletroforese capilar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> Figura 3: qRT-PCR análise de IVTs de controle. Transcrições in vitro metiladas e não metiladas foram utilizadas como controles positivos e negativos do ensaio MeRIP, respectivamente. Após a imunoprecipitação, o IVT metilado é altamente enriquecido na amostra IP (verde), mas não na amostra Mock (sem anticorpo anti-m5C; roxo). O IVT não metilado não mostrou enriquecimento e nenhuma diferença entre IP e Mock. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> Figura 4: Leia o alinhamento antes e depois do MeRIP em torno de uma transcrição representativa. Leituras alinhadas a uma transcrição específica na amostra de entrada (linha superior) e em duas réplicas IP (linha média e inferior). A caixa preta mostra uma janela de 50 nt de comprimento enriquecida identificada com base nas análises macs243 e MeRIP-seq22 peak-calling. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Alvo</td>
			<td colspan="2">Par de primer</td>
			<td colspan="2">Sequência do produto</td>
			<td>Comprimento do produto</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">EGFP</td>
			<td colspan="2">Para: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC</td>
			<td rowspan="2">72 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Renilla luciferase</td>
			<td colspan="2">Para: 5'-GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC ATGTTGCCATCAAAAAATCATGAGAA AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC</td>
			<td rowspan="2">75 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Informações sobre os primers e produtos gerados para a análise qRT-PCR.
Receitas tampão. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

O ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado é um método à base de anticorpos usado para enriquecer para fragmentos de RNA metilado. Juntamente com sequenciamento profundo, leva à identificação de transcrições carregando a modificação m5C.

Ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado para estudar m5C modificação em Arabidopsis

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

methylated-rna-immunoprecipitation-assay-to-study-m5c-modification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

6.5K visualizações.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. O ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado é um método à base de anticorpos usado para enriquecer para fragmentos de RNA metilado. Juntamente com sequenciamento profundo, leva à identificação de transcrições carregando a modificação m5C.

Vídeo: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

Um método para medir RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modificações nas células e tecidos

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Bioquímica

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Genética

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Um ensaio In Vitro para detectar a atividade de Transferase de tRNA-isopentenilo

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

Teste anticorpo-livre para a análise da atividade do methyltransferase do RNA

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a variety of human retinal degenerative diseases and pinpoint new treatment approaches. The nuclear architecture of mouse retina is organized in two different patterns: conventional and inverted. Conventional pattern is universal where heterochromatin is localized to the periphery of the nucleus, while active euchromatin resides in the nuclear interior. In contrast, inverted nuclear pattern is unique to the adult rod photoreceptor cell nuclei where heterochromatin localizes to the nuclear center, and euchromatin resides in the nuclear periphery. DNA methylation is predominantly observed in chromocenters. DNA methylation is a dynamic covalent modification on the cytosine residues (5-methylcytosine, 5mC) of CpG dinucleotides that are enriched in the promoter regions of many genes. Three DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) participate in methylation of DNA during development. Detecting 5mC with immunohistochemical techniques is very challenging, contributing to variability in results, as all DNA bases including 5mC modified bases are hidden within the double-stranded DNA helix. However, detailed delineation of 5mC distribution during development is very informative. Here, we describe a reproducible technique for robust immunohistochemical detection of 5mC and another epigenetic DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which colocalizes with the &#34;open&#34;, transcriptionally active chromatin in developing and postmitotic mouse retina.

The objective of this report is to describe the protocol for robust immunohistochemical detection of epigenetic markers, 5-methylcytosine (5mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in developing and postmitotic mouse retina.

Deteção de immunohistochemical da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina no desenvolvimento e Mouse Postmitotic Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Biologia do Desenvolvimento

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Caracterizando modificações de RNA em neurônios únicos usando espectrometria de massa

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Química

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Determinação de metilação de DNA de genes marcados em Arabidopsis Endosperma

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Biologia

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Neurociência

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as epitranscriptomics. Among others, N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C) RNA modifications have been described on mRNA molecules and may have a role in modulating cellular processes. Epitranscriptomics is thus a new layer of regulation that must be considered in addition to transcriptomic analyses, as it can also be altered or modulated by exposure to any chemical or biological agent, including viral infections.
Here, we present a workflow that allows analysis of the joint cellular and viral epitranscriptomic landscape of the m6A and m5C marks simultaneously, in cells infected or not with the human immunodeficiency virus (HIV). Upon mRNA isolation and fragmentation from HIV- infected and non-infected cells, we used two different procedures: MeRIP-Seq, an RNA immunoprecipitation-based technique, to enrich for RNA fragments containing the m6A mark and BS-Seq, a bisulfite conversion-based technique, to identify the m5C mark at a single nucleotide resolution. Upon methylation-specific capture, RNA libraries are prepared for high-throughput sequencing. We also developed a dedicated bioinformatics pipeline to identify differentially methylated (DM) transcripts independently from their basal expression profile.
Overall, the methodology allows exploration of multiple epitranscriptomic marks simultaneously and provides an atlas of DM transcripts upon viral infection or any other cell perturbation. This approach offers new opportunities to identify novel players and novel mechanisms of cell response, such as cellular factors promoting or restricting viral replication.

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in viral infections is just starting to be explored and could highlight new viral-host interaction mechanisms. In this work, we provide a pipeline to investigate m6A and m5C RNA modifications in the context of viral infections.

Explorando epitransomos m6A e m5C sobre infecção viral: um exemplo com HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado para estudar m⁵C modificação em Arabidopsis

Resumo

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