Diese Arbeit wurde durch ein IMPRS PhD Stipendium an E.S, ein EMBO Long-Term Fellowship an V.P., und MPI-MPP interne Mittel an F.K. unterstützt. Ein Teil dieser Arbeit wurde auch durch PLAMORF finanziert, ein Projekt, das vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizont 2020 der Europäischen Union (Grant Agreement No. 810131) gefördert wurde. Die Autoren danken Federico Apelt für die bioinformatische Analyse und Kommentare zum Manuskript und Mathieu Bahin und Amira Kramdi für die bioinformatische Analyse.

1. Vorbereitung der RNA
<ol><li>Schleifen Sie 200 mg Pflanzengewebe zu Pulver in flüssigem Stickstoff, um sicherzustellen, dass das Gewebe während des gesamten Verfahrens eingefroren bleibt.</li>
	<li>Extrahieren Sie die RNA aus dem gewünschten Pflanzengewebe nach einem sauren Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsprotokoll. Um die Möglichkeit zu verringern, RNA während der Phasentrennung mit DNA zu kontaminieren, verwenden Sie 1-Brom-3-Chlorpropan anstelle von Chloroform.<ol>
<li>Fügen Sie dem gemahlenen Pflanzengewebe 1 ml RNA-Extraktionsreagenz, das Guanidinthiocyanat und Saursäurephenol enthält, hinzu (500 l pro 100 mg Gewebe). Mischen Sie gut, indem Sie umkehren und stellen Sie sicher, dass das gesamte Gewebe nass ist. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Ribonukleoproteinkomplexe zu dissoziieren.</li>
		<li>Zentrifuge für 10 min bei 12.000 x g bei 4 °C und überträgt den Überstand auf ein neues 1,5 ml Rohr.</li>
		<li>Fügen Sie 200 l 1-Brom-3-Chlorpropan (100 l pro 500 l RNA-Extraktionsreagenz) und Wirbel kräftig hinzu.</li>
		<li>Zentrifuge für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C und überträgt die obere wässrige Phase (ca. 500 l) auf ein neues 1,5 ml-Rohr.</li>
		<li>1 Volumen Isopropanol (500 l) und 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat pH 5,5 (50 l) hinzufügen, gut durch Invertieren mischen und 10 min bei -20 °C ausfallen. HINWEIS: Die Verwendung von Natriumacetat (NaOAc) wird empfohlen, um die RNA-Ausfällung zu verbessern. Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden, indem der Niederschlag der RNA um einige Stunden oder sogar über Nacht verlängert wird.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie 30 min bei 12.000 x g bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Waschen Sie das Pellet zweimal mit 500 l 80% EtOH, Zentrifuge für 5 min bei 12.000 x g bei 4 °C und entsorgen.</li>
		<li>Waschen Sie das Pellet einmal mit 500 l 99% EtOH, Zentrifuge für 5 min bei 12.000 x g bei 4 °C und entsorgen.</li>
		<li>Das Pellet 5-10 min trocknen und in 30 l RNase-freiH2O auflösen. HINWEIS: Verwenden Sie stattdessen ein beliebiges RNA-Extraktionsprotokoll (z. B. ein säulenbasiertes System). Wenn eine DNase-Verdauung im Protokoll enthalten ist, überspringen Sie sie im folgenden Schritt (Schritt 1.3).</li>
	</ol></li>
	<li>Messen Sie die RNA-Konzentration (z.B. mit Einem Spektralphotometer) und verdauen Sie 20 g RNA mit DNase. HINWEIS: DNA ist reich an m5C und der Antikörper unterscheidet nicht zwischen DNA und RNA.<ol>
<li>In einer typischen DNase-Reaktion behandeln Sie 10 g RNA in einer 50-L-Reaktion. Mischen Sie die folgenden Komponenten und inkubieren Sie die Reaktion(en) bei 37 °C für 30 min: 10 g RNA x L 10x DNase-Puffer 5 l DNase 1 l (2 Stück) RNase-frei H2O bis 50 l</li>
		<li>Entfernen Sie das Enzym entweder durch Zugabe eines geeigneten Volumens von DNase-Inaktivierungsreagenz (wenn es im DNase-Kit enthalten ist und gemäß den Anweisungen des Herstellers) oder durch durchführung einer Bereinigungsstufe (z. B. Spaltenreinigung oder Phenol-/Chlorformextraktion).</li>
	</ol></li>
	<li>Überprüfen Sie die Qualität und Reinheit der isolierten RNA durch kapillare Elektrophorese und fahren Sie fort, wenn die RNA-Integritätsnummer (RIN) höher als 7 ist, um sicherzustellen, dass die Proben von guter Qualität sind.</li>
	<li>OPTIONAL: Entfernen Sie die ribosomale RNA, um die Proben im mRNA-Gehalt mit einem rRNA-Entfernungskit und gemäß dem Herstellerprotokoll anzureichern.<ol>
<li>Verwenden Sie die von DNase behandelte RNA aus dem vorherigen Schritt für die rRNA-Erschöpfungsreaktion(n). Führen Sie mehrere Reaktionen durch, wenn die Menge der gesamten RNA mehr als die maximale Menge ist, die für die Reaktion vorgeschlagen wird.</li>
		<li>Beachten Sie, dass nur 5-10% des Eingangsbetrags nach rRNA-Erschöpfung wiederhergestellt werden. Fahren Sie mit der rRNA-entreicherten RNA (gleiche Menge für alle Proben) fort und ignorieren Sie die in den folgenden Schritten genannten Mengen, da sie sich auf die gesamte RNA beziehen. HINWEIS: Für einen Vergleich und eine Beschreibung der verfügbaren rRNA-Erschöpfungsmethoden siehe Referenzen 38,39,40. rRNA ist der Hauptteil der gesamten RNA und wird in vielen Organismen m5C methyliert.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie im Voraus In-vitro-Transkripte (IVT) zur Verwendung als Kontroll-RNA-Sequenzen vor und fügen Sie sie in die Proben ein.<ol>
<li>Produzieren Sie zwei verschiedene IVTs mit einem In-vitro-Transkriptionskit, eines mit nicht-methylierten Nukleosiden und eines, bei dem rCTP durch 5-Methyl-rCTP ersetzt wird, um als negative bzw. positive Kontrollen in MeRIP zu dienen. Die Transkripte wurden von EGFP und Renilla luciferase erstellt. HINWEIS: Die IVTs sollten nicht in dem Transkriptom des Organismus existieren, den Sie analysieren. Wenn die IVTs aus der gleichen Vorlage stammen (z. B. beide EGFP), fügen Sie die positive und die negative Kontrolle in zwei verschiedenen Stichproben hinzu. Wenn ihre Reihenfolge unterschiedlich ist (z. B. EGFP und Renilla), können sie derselben Probe hinzugefügt werden.</li>
		<li>Spike in jeder Probe 0,1 ng IVT pro 3 g RNA, als Kontrollen.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonicate die RNA auf ca. 100 nt Fragmente. HINWEIS: Die Bedingungen für das RNA-Scheren müssen im Voraus angepasst werden und unterscheiden sich für jeden Beschallungser. Für das hier verwendete Modell wird die Beschallung unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Spitzenleistung 174, Duty-Faktor 10, Zyklen/Burst 200, 17 min.<ol>
<li>Beschallen Sie die gleiche RNA-Menge für alle Proben, mindestens 12 g RNA pro Probe in 80 l Gesamtvolumen (min 60 l, max. 100 l), gefüllt mit RNase-freier H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestätigen Sie die Effizienz der Beschallung und die Konzentration der RNA-Proben durch Kapillarelektrophorese. Die durchschnittliche Größe der fragmentierten RNA sollte etwa 100 nt betragen.</li>
</ol>2. Methylierte RNA-Immunpräzipitation (MeRIP)
<ol><li>In bindungsarmen Röhrchen fügen Sie je nach Konzentration 9 g beschallte RNA und RNase-freieH2O bis zu 60 l (oder mehr) hinzu.</li>
	<li>Dissoziieren Sie die Sekundärstrukturen, indem Sie die RNA bei 70 °C in einem Wasserbad für 10 min erwärmen und für weitere 10 min in einem Eis-Wasser-Mix abkühlen.</li>
	<li>Teilen Sie die Probe in drei Teile auf: Ein Drittel (20 l, wenn in Schritt 2.1 60 l genommen wurden) wird in einem separaten Rohr bei -80 °C als Eingangsprobe gespeichert. Füllen Sie die restlichen 40 l mit RNase-frei H2O bis zu 860 l und teilen Sie sie dann in zwei niedrigbindende Rohre: eine für IP und eine für die Mock-Steuerung (jeweils 430 l).</li>
	<li>Zu beiden Röhren hinzufügen: 50 l mit 10x MeRIP-Puffer 10 L RNase-Inhibitor 10 l α-m-5-C-Antikörper (10 g) in der IP-Probe pro 10 lH2O in der Mock-Probe HINWEIS: Der zuvor verwendete Antikörperklon ist nicht mehr kommerziell erhältlich. Jedoch, Jeder Anti-5-Methylcytosin monoklonalen Antikörper sollte ähnlich arbeiten. Antikörper sollten vor der Verwendung für MeRIP11,23auf Spezifität getestet werden.</li>
	<li>Versiegeln Sie die Rohre mit Parafilm und inkubieren Sie 12-14 Stunden bei 4 °C, mit Oberleitungsrotation.</li>
	<li>Am nächsten Tag bereiten Sie das Protein G magnetische Perlen für die Bindung.<ol>
<li>Verwenden Sie für jedes Rohr (entweder IP- oder Mock-Steuerung) 40 L Perlen. Addieren Sie die Gesamtmenge der Perlen (z. B. 15 ml In einem 15 ml-Rohr) und waschen Sie sie dreimal mit 800 l 1x 1x MeRIP-Puffer pro Probe (z. B. Tuben x 800 L Puffer, z. B. 3,2 ml für 2 IP- und 2 Mock-Proben).</li>
		<li>Waschen bei Raumtemperatur für 5 min mit Overhead-Rotation durchführen, die Perlen mit Hilfe eines magnetischen Racks sammeln und den Waschpuffer entsorgen. Nach der dritten Wäsche die Perlen im gleichen Volumen des 1x MeRIP-Puffers wie das Anfangsvolumen der entnommenen Perlen (z. B. 160 l 1x MeRIP-Puffer für 2 IP- und 2 Mock-Proben) wieder aufsetzen. HINWEIS: Die Menge der verwendeten Protein-G-Perlen wird durch die Bindungskapazität der Perlen für den spezifischen Antikörpertyp und die Menge der verwendeten Antikörper bestimmt. In diesem Fall haben die Perlen eine Bindungskapazität von ca. 8 g Maus-IgG pro mg Perlen und 30 mg/ml Konzentration. Daher reichen 40 l aus, um ca. 9,6 g Antikörper zu binden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie jeder IP- und Mock-Probe 40 L resuspendierte Perlen hinzu und brüten sie für weitere 2 Stunden bei 4 °C mit Overhead-Rotation.</li>
	<li>Legen Sie die Rohre 1 min auf ein magnetisches Rack und entsorgen Sie den Überstand oder speichern Sie ihn als Kontrolle (nicht gebundene RNA-Probe).</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen 5 Mal, indem Sie in 700 l 1x MeRIP-Puffer mit 0,01% Tween 20 und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur mit Overhead-Rotation wieder aufhängen.</li>
	<li>Die gewaschenen Perlen in 200 l Proteinase-K-Verdauungspuffer wieder aufhängen und 3,5 l Proteinase K hinzufügen. 3 Stunden bei 50 °C inkubieren und bei 800 Umdrehungen pro Minute schütteln. Gelegentlich streichen Sie manuell den Boden des Rohres, wenn sich während der Inkubation ein Sediment von Perlen bildet.</li>
	<li>Extrahieren Sie die RNA durch Zugabe von 800 L RNA-Extraktionsreagenz und nach einem sauren Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsprotokoll, und fahren Sie wie in Schritt 1.2 fort. Um die Sichtbarkeit des RNA-Pellets zu erhöhen, kann ein farbiges Co-Gefällt mir in Isopropanol beim Fällungsschritt zugesetzt werden. Setzen Sie das Pellet in 20 l RNase-freiH2 O(oder gleich dem Eingangsvolumen in Schritt 2.3) wieder auf.</li>
</ol>3. Nachgelagerte Analyse
<ol><li>Senden Sie die Eingabe- und IP-Beispiele für die Single-End-Sequenzierung mit 50 Basen Leselänge (SE50).</li>
	<li>Trim 3' Endadapter mit cutadapt41 und discard reads, die kürzer als 48 nt sind.</li>
	<li>Karte getrimmt liest das Arabidopsis Genom (TAIR10-Anmerkung) mit STAR42 mit einem Cutoff von 6% für Inkongruenzen und maximale Introngröße von 10 kb. Bewahren Sie die eindeutig zugeordneten Lesevorgänge für weitere Analysen auf.</li>
	<li>Identifizieren Sie angereicherte RNA-Fragmente in IP-Proben im Vergleich zu Input mit zwei unterschiedlichen Methoden und betrachten Sie diejenigen, die durch beide signifikant angereichert sind.<ol>
<li>Erkennen Sie zunächst MeRIP-Seq-Peaks mithilfe des MACS2-Spitzenrufers43 auf gepoolten IPs im Vergleich zu Input.</li>
		<li>Zweitens folgen Sie der Analyse für MeRIP-seq Peak Calling, wie in Meyer et al.22 und Yang et al.17beschrieben.<ol>
<li>Teilen Sie das Genom mithilfe benutzerdefinierter R-Skripte in unterschiedliche 25 nt-Fenster auf und zählen Sie die Anzahl der eindeutig zugeordneten Lesevorgänge für jedes Fenster basierend auf der Position des letzten zugeordneten Nukleotids (da die Lesevorgänge aus 100 nt RNA-Fragmenten stammen).</li>
			<li>Berechnen Sie deutlich angereicherte Fenster in IP-Samples im Vergleich zu Input mit dem Fisher Exact Test. Verwenden Sie das Benjamini-Hochberg-Verfahren, um mehrere Tests zu korrigieren.</li>
			<li>Halten Sie die deutlich angereicherten Spitzen, die sich über mindestens zwei aufeinander folgende Fenster erstrecken, und verwerfen Sie Spitzen, die nur ein Fenster abdecken.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifizieren Sie annotierte Regionen des Genoms (Transkripte) mit signifikant angereicherten Spitzen, die durch beide Methoden gefunden werden.</li>
	<li>Alternativ oder komplementär testen Sie spezifische RNA-Targets für ihre Anreicherung in den IP-Proben.<ol>
<li>Transkribieren Sie die RNA (gleiches Volumen von Input-, IP- und Mock-Proben) mit zufälligen Hexamern um.</li>
		<li>Führen Sie quantitative Echtzeit-PCR auf den ausgewählten Zielen durch und vergleichen Sie Input, IP und Mock über die Methode "Ct". HINWEIS: Das generierte Produkt sollte nicht länger als 100 bp sein, da dies die durchschnittliche Fragmentierungsgröße ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu offenbaren.

RNA enthält mehr als hundert verschiedene Basismodifikationen4, die das Epitranskriptom44bilden. Diese Änderungen fügen eine zusätzliche Schicht der Regulierung der Übersetzung und Signalisierung (überprüft in5,6,8,20,45,46). Frühe Studien konnten das Vorhandensein von post-transkriptionellen Modifikationen an RNA28,47 feststellen, aber die spezifischen modifizierten RNAs müssen identifiziert werden, um die Rolle der Epitranskriptomik zu verstehen. MeRIP wurde als Methode zur Kartierung von RNA-Methylierungsstellen Transkriptom-weit21,22entwickelt. Es kann an jede Modifikation angepasst werden, wenn ein spezifischer Antikörper verfügbar ist.
Die Hauptstärke dieses Protokolls ist, dass relativ einfach, sicher für die RNA und den Benutzer (z.B. 5-azaC ist hochgiftig für Pflanzen und Menschen) und erfordert keine Sequenz- oder Änderungsenzyminformationen. Darüber hinaus erhöht die Anreicherung methylierter RNAs durch das UZ die Wahrscheinlichkeit, dass niedrig reichlich eMRnAs nachgewiesen werden können, im Gegensatz zur Bisulfitsequenzierung, die keinen Anreicherungsschritt enthält. Wenn zwei serielle Runden von MeRIP durchgeführt werden, erhöht sich die Anreicherung in RNA-Fragmenten, die Methylierungsstellen enthalten, umweitere 22. Eine der Einschränkungen von MeRIP, insbesondere bei mRNA-Methylierungsstudien, ist die hohe RNA-Menge, die als Input für den Assay benötigt wird. Der Ribodepletion – oder Poly(A)-Anreicherung – reduziert den Hintergrund, der durch die stark modifizierte ribosomale RNA verursacht wird, entfernt aber mehr als 90% der gesamten RNA. Die DNA muss auch vollständig entfernt werden, da sie reich an 5-methylierten Zytosinen ist. Ein weiterer Nachteil ist die niedrigere Auflösung der genauen Position der Methylierung. Die Beschallung der RNA vor der Inkubation mit dem Antikörper hilft in diese Richtung, indem der Bereich, der die Modifikation enthält, auf 100-200 Nukleotide eingeengt wird. Wenn MeRIP mit einer tiefen Sequenzierung kombiniert wird, erhöht sich die Auflösung der m5C-Standortvorhersage, wenn die Sequenzierungslesungen eine Gaußsche Verteilung um die potenzielle Methylierungsstelle bilden. Zusätzlich muss die Spezifität des Antikörpers vor dem Test bestätigt werden (z.B. mit RNA-Dot-Blot-Assays, die mit Oligos durchgeführt werden, die mit modifizierten Nukleotiden synthetisiert werden), inwieweit ein Antikörper tatsächlich zwischen eng verwandten Modifikationen unterscheiden kann (z.B. m6A und m6Am), ein Argument punktierend im Feld48,49. Darüber hinaus könnten hochstrukturierte RNAs die Antikörper-Antigen-Interaktion beeinträchtigen, eine weitere Einschränkung, die meist mit Fragmentierung und Denaturierung von RNA vor dem GEISTIGEN Schutz der RNA angegangen wird. Im Gegenteil, die Bisulfitsequenzierung, die auch von sekundären Strukturen beeinflusst wird, enthält keinen Fragmentierungsschritt, und dies könnte ein Grund dafür sein, dass die m5C-Standorte und die mRNAs, die durch die Bisulfitsequenzierung16 und MeRIP-seq11,17vorhergesagt werden, diskrepanziert werden. Andere Zytosinmodifikationen (z.B. hm5C) sind ebenfalls resistent gegen Bisulfit-vermittelte Deamination35.
Zu den Modifikationen von MeRIP-seq gehören ein Vernetzungsschritt, entweder mit der Einführung eines photoaktivierbaren Ribonukleosids (foto-vernetzungsunterstützt m6A-seq, PA-m6A-seq 50) oder mit UV-Licht zur Herstellung von Antikörper-RNA-Kreuzlinks nach der IP (miCLIP49, andere Methode als die in Einführung30beschriebene miCLIP). In zukunftdessen und da sich das Wissen über die RNA-Methylierung ansammelt, könnten gezieltere Ansätze vorzuziehen sein, basierend auf den modifizierenden Enzymen und/oder den Konsenssequenzen, in denen Methylierung auftritt. Die Identifizierung von Leseproteinen ist für das Verständnis der molekularen und Signalfunktion posttranskriptieller Modifikationen unerlässlich. Die Nanoporen-Sequenzierungstechnologie ermöglicht bereits die direkte Identifizierung modifizierter Nukleotide ohne vorherige Behandlung der RNA17, aber es gibt noch Raum für Verbesserungen in diesem Bereich in Bezug auf Sequenztiefe und bioinformatische Analyse. Insgesamt ist MeRIP-seq derzeit ein etablierter, zuverlässiger und unvoreingenommener Ansatz zur Identifizierung methylierter RNA-Transkripte.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.

Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

In allen drei Lebensreichen werden RNA-Arten post-transkriptionellen Modifikationen unterzogen, und die Forschung an diesen funktional relevanten biochemischen Modifikationen wird als "Epitranskriptomik" bezeichnet. Epitranskriptomik ist ein wachsendes Feld und verschiedene Methoden werden entwickelt, um die Modifikationen an RNA-Molekülen zu untersuchen und zu kartieren (rezensiert in1,2). Es wurden mehr als hundert RNA-Modifikationen gefunden, die in rRNAs, tRNAs, anderen ncRNAs sowie mRNAs3,4nachgewiesen wurden. Obwohl das Vorhandensein und die Funktion chemisch unterschiedlicher posttranskriptionärer Modifikationen in tRNAs und rRNAs ausgiebig untersucht werden5,6,7,8, erst vor kurzem wurden mRNA-Modifikationen charakterisiert. In Pflanzen wurden bisher viele mRNA-Modifikationen identifiziert, darunter m7G an der Kappenstruktur9, m1A10, hm5C11,12und Uridylierung13. Allerdings wurden nur m6A10,14,15, m5C11,16,17und Pseudouridin18 transkriptomweit in Arabidopsis kartiert. Post-transkriptionsbasierte mRNA-Basismodifikationen sind an mehreren Entwicklungsprozessen beteiligt19,20.
Einer der am häufigsten verwendeten Ansätze in der Epitranskriptomik ist die methylierte RNA-Immunpräzipitation gekoppelt mit tiefer Sequenzierung (MeRIP-seq). MeRIP-seq wurde 2012 entwickelt, um m6A in Säugetierzellen21,22zu untersuchen. Es erfordert die Verwendung eines Antikörpers für die gewünschte Modifikation und zielt darauf ab, für RNA-Fragmente mit dem modifizierten Nukleotid(n) anzureichern. Es folgt in der Regel eine tiefe Sequenzierung, um die angereicherten Fragmente oder quantitative PCR zu identifizieren und zu zuordnen, um bestimmte RNA-Ziele zu überprüfen. Die Genauigkeit von MeRIP basiert auf der Spezifität des Antikörpers, um das modifizierte Nukleotid bei ähnlichen Modifikationen zu erkennen (z. B. m5C und hm5C11,23). Neben m6A wurde MeRIP-seq auch zur Untersuchung m1A und m5C RNA-Methylierung in mehreren Organismen11,17,23,24,25angewendet.
Die Methylierung des Cytosins an der fünften Kohlenstoffposition (m5C) ist die am weitesten verbreitete DNA-Modifikation26,27 und eine der häufigsten RNA-Modifikationen auch3,4. Während m5C in eukaryotischen mRNAs im Jahr 197528nachgewiesen wurde, haben erst vor kurzem Studien auf die Kartierung der Modifikation Transkriptome-weit konzentriert, in der Codierung und nicht-Codierung RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.
Alternative Methoden, die in der m5C-RNA-Forschung verwendet werden, umfassen die chemische Umwandlung von nicht-methylierten Zytosinen in Uracils (Bisulfitsequenzierung) und Immunpräzipitationstests, die auf einer irreversiblen Bindung einer bekannten RNA-Cytosin-Methyltransferase an ihre RNA-Targets basieren (miCLIP, aza-IP). Kurz gesagt, bisulfitsequenzierung nutzt das Merkmal von 5-methyliertem Cytosin, um gegen Natriumbisulfitbehandlung resistent zu sein, die unmodifizierte Cytosine zu Uracil deaminiert. Die Methode wurde zuerst für DNA entwickelt, aber auch für RNA angepasst und viele Studien haben diesen Ansatz gewählt, um m5C-Sites in RNA16,23,29,32,34,35zu detektieren. Sowohl miCLIP als auch aza-IP erfordern Vorkenntnisse der RNA-Cytosin-Methyltransferase und die Verwendung des jeweiligen Antikörpers. Bei miCLIP (Methylierung Individuell-Nukleotid-Auflösung Vernetzung und Immunpräzipitation) trägt die Methyltransferase eine einzige Aminosäuremutation, so dass sie an das RNA-Substrat bindet, aber nicht freigegeben werden kann30. Bei Aza-IP (5-Azacytidin-vermittelte RNA-Immunpräzipitation) wird die irreversible Bindung zwischen dem 5-AzaC-Nukleosid und der RNA-Cytosinmethyltransferase gebildet, wenn exogen bereitgestelltes 5-AzaC durch RNA-Polymerasen in ein Ziel-RNA-Molekül31eingearbeitet wird.
Der Hauptvorteil dieser drei Methoden besteht darin, dass sie eine einzige Nukleotidauflösungszuordnung von m5C ermöglichen. Darüber hinaus liefern miCLIP und aza-IP Informationen über die spezifischen Ziele einer ausgewählten RNA-Cytosin-Methyltransferase und entschlüsseln den Mechanismus und die Rolle posttranskriptionaler RNA-Modifikationen tiefer. Der MeRIP-seq-Ansatz kann jedoch Transkriptom-weite m5C-Regionen ohne vorherige Kenntnisse identifizieren und vermeidet raue chemische und Temperaturbedingungen wie Bisulfitbehandlung oder Inkubation mit 5-azaC. Sowohl die MeRIP- als auch die Bisulfitsequenzierung können durch sekundäre RNA-Strukturen gehemmt werden36. Der Fragmentierungsschritt, der im MeRIP-Test vor der Immunpräzipitation enthalten ist, zielt darauf ab, die Antikörperbindung zu erleichtern und die Auflösung der m5C-Identifikation zu erhöhen.
Eine weitere erwähnenswerte Methode ist die Massenspektrometrie (MS) von RNA-Nukleosiden. MS kann jede Art von Modifikation sowohl auf DNA als auch auf RNA erkennen und unterscheiden. Kurz gesagt, RNA wird extrahiert und DNase verdaut, dann entsalzt und zu einzelnen Nukleosiden verdaut. Die RNA-Nukleoside werden mit einem Massenspektrometer analysiert. Diese Methode kann verwendet werden, um die Ebenen jeder Modifikation zu quantifizieren und es ist nicht auf einen Antikörper oder eine chemische Umwandlung angewiesen. Jedoch, ein großer Nachteil ist, dass es Masseninformationen über das Vorhandensein von RNA-Modifikationen bietet. Um die Modifikationen abzubilden, muss MS mit RNase-Verdauungs- und Sequenzierungsinformationen über bestimmte RNA-Moleküle kombiniert werden, wie im Fall von humanen tRNALeu(CAA)37.
Hier beschreiben und diskutieren wir den MeRIP-Assay, der zur Untersuchung der m5C-RNA-Methylierung in Arabidopsis17verwendet wird.

<table><tbody><tr><td>anti-m&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;C antibody</td><td>ZymoResearch</td><td>A3001 (discontinued), A3002 available</td><td>Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available</td></tr><tr><td>Chip and reagents for capillary electrophoresis</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 6000 Nano kit</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td>TURBO DNA-free kit</td></tr><tr><td>Co-precipitant of nucleic acids</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>Glycoblue, 15 mg/mL</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vitro&lt;/em&gt; transcription kit</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System</td></tr><tr><td>Low-binding reaction tubes</td><td>Kisker Biotech</td><td>G017</td><td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Protein G magnetic beads</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dynabeads Protein G</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>20mg/mL stock solution, RNA grade</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>RNasin Plus 40 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>rRNA removal kit</td><td>Epicentre</td><td>RZPL11016</td><td>Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)</td></tr><tr><td>Sonication tubes</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td></tr><tr><td>RNA extraction reagent</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol reagent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillary electrophoresis machine</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>2100 Bioanalyzer System</td></tr><tr><td>Magnetic rack</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>discontinued</td><td>5417R model</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Benchmark</td><td>R4040</td><td>RotoBot Mini</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>S220 Focused-ultrasonicator</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>NanoDrop OneC</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1012</td><td>1012 Incubation bath</td></tr></tbody></table>

methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis

Sekundäre Basismodifikationen an der RNA, wie z.B. m5C, beeinflussen die Struktur und Funktion der modifizierten RNA-Moleküle. Methylierte RNA-Immunpräzipierung und -sequenzierung (MeRIP-seq) ist eine Methode, die darauf abzielt, methylierte RNA anzureichern und schließlich modifizierte Transkripte zu identifizieren. Kurz gesagt, wird beschallte RNA mit einem Antikörper für 5-methylierte Zytosine inkubiert und mit Hilfe von Protein-G-Perlen gefällt. Die angereicherten Fragmente werden dann sequenziert und die potenziellen Methylierungsstellen basierend auf der Verteilung der Lese- und Peak-Erkennung abgebildet. MeRIP kann auf jeden Organismus angewendet werden, da es keine vorherige Sequenz oder Modifizieren von Enzymkenntnissen erfordert. Darüber hinaus wird DIE RNA neben der Fragmentierung keiner anderen chemischen oder Temperaturbehandlung unterzogen. MeRIP-seq liefert jedoch keine Einzelnukleotidvorhersage der Methylierungsstelle wie andere Methoden, obwohl der methylierte Bereich auf wenige Nukleotide eingeengt werden kann. Die Verwendung verschiedener modifikationsspezifischer Antikörper ermöglicht es, MeRIP an die verschiedenen Basismodifikationen auf RNA anzupassen, wodurch die möglichen Anwendungen dieser Methode erweitert werden.

Ein Schaltplan der Methode ist in Abbildung 1dargestellt. Die ersten kritischen Schritte des Protokolls sind die Gewinnung von RNA von guter Qualität (RIN ≥ 7) und die Beschallung auf ca. 100 nt Fragmente. Die Effizienz beider Schritte wird von einer spanbasierten Kapillarelektrophoresemaschine untersucht. In Abbildung 2Awird ein repräsentativer Lauf einer guten RNA-Probe gezeigt. Die Probe wird vor dem Laden auf dem Chip 1:10 verdünnt, um eine Konzentration zu erreichen, die im Erfassungsbereich des verwendeten Kits liegt (5-500 ng/l). Das gleiche Sample wird auch nach der Beschallung ausgeführt und ist in Abbildung 2Bdargestellt. Beachten Sie das Vorhandensein eines einheitlichen Peaks, der sich links vom Diagramm mit einer Größe von etwa 100 Nukleotiden bewegt. Die geringere Konzentration wird sowohl durch den Verlust der RNA während der Fragmentierung als auch durch das erhöhte Volumen der Proben (60-100 l, Schritt 1.7.1) verursacht.
Die Qualität der IP- und Mock-Samples kann mit qRT-PCR bewertet werden. Zu diesem Zweck dienen die eingespritzten IVTs als positive und negative Kontrollen: Die methylierte IVT, bei der in allen Cytosinpositionen m5C liegt, wird voraussichtlich in der IP-Probe stark angereichert; im Gegenteil, die nicht methylierte IVT sollte keinen Unterschied zwischen IP und Mock haben. Die im qRT-PCR-Assay für die beiden Steuer-IVTs(EGFP und Renilla luciferase) verwendeten Primer sind in Tabelle 1aufgeführt. Wie in Abbildung 3dargestellt, wurden etwa 80 % der methylierten IVT in der IP-Probe und nur etwa 2 % im Mock zurückgewonnen. Bei der nicht-methylierten Kontrolle lag die Wiederherstellung sowohl in IP- als auch in Mock-Proben unter 1%. Dies bestätigt die Effizienz von MeRIP, dass methylierte RNA-Fragmente gefällt und angereichert wurden, und ist ein guter Indikator dafür, dass die Proben für nachgelagerte Analysen verwendet werden können. Darüber hinaus kann die Faltenanreicherung des nicht-methylierten IVT (IP-zu-Mock-Verhältnis) als Schwellenwert für die Schätzung der Signifikanz der Anreicherung in den qRT-PCR-Assays angewendet werden.
Nach dem Ausrichten der Lesevorgänge am Genom (Abbildung 4) werden die in den Schritten 3.4.1 und 3.4.2 beschriebenen Spitzenaufrufalgorithmen angewendet, um die statistisch signifikanten Fenster zu identifizieren, die in den IP-Beispielen im Vergleich zur Eingabe angereichert sind. Die Sequenzen, die diesen Fenstern entsprechen, können weiter verwendet werden, um z.B. nach konservierten Methylierungsmotiven11,17zu suchen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des MeRIP-seq-Protokolls. RNA-Proben werden mit einem Antikörper für 5-methylierte Zytosine inkubiert und die Komplexe werden mit Protein-G-Magnetperlen nach unten gezogen, die die Antikörper zusammen mit der gebundenen RNA erfassen. Die eluierten RNA-Proben werden durch Tiefe Sequenzierung und qRT-PCR analysiert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse aus der Qualitätsanalyse von RNA-Proben. (A) Repräsentatives Profil einer qualifizierten RNA-Gesamtprobe. (B) Repräsentatives Profil einer RNA-Probe nach Beschallung auf 100 nt Fragmente. Ausgabedateien aus der Kapillarelektrophorese-Software. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> Abbildung 3: qRT-PCR-Analyse von Steuer-IVTs. Methylierte bzw. nicht-methylierte In-vitro-Transkripte wurden als positive bzw. negative Kontrollen des MeRIP-Assays verwendet. Nach Derpräzipitierung ist das methylierte IVT in der IP-Probe hoch angereichert (grün), aber nicht in der Mock-Probe (ohne Anti-m5C-Antikörper; violett). Die nicht methylierte IVT zeigte keine Anreicherung und keinen Unterschied zwischen IP und Mock. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> Abbildung 4: Lesen Sie die Ausrichtung vor und nach MeRIP um ein repräsentatives Transkript. Liest, die an einem bestimmten Transkript im Eingabebeispiel (obere Zeile) und in zwei IP-Replikationen (mittlere und untere Zeile) ausgerichtet sind. Die Blackbox zeigt ein identifiziertes angereichertes 50 nt langes Fenster basierend auf MACS243 und MeRIP-seq22 Peak-Calling-Analysen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ziel</td>
			<td colspan="2">Primer-Paar</td>
			<td colspan="2">Produktsequenz</td>
			<td>Produktlänge</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">EGFP</td>
			<td colspan="2">Für: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGCAACTACACAACCCGCGCCGAG GTGAAGGAGGAGGGCGACACCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC</td>
			<td rowspan="2">72 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Renilla luciferase</td>
			<td colspan="2">Für: 5'- GGAGAATAACTTCTCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGAGAATAACTTCGTGTGGAAACC ATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAA AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC</td>
			<td rowspan="2">75 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Informationen zu den Primern und generierten Produkten für die qRT-PCR-Analyse.
Puffer-Rezepte. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Der methylierte RNA-Immunpräzipitationstest ist eine Antikörper-basierte Methode zur Anreicherung für methylierte RNA-Fragmente. Gekoppelt mit einer tiefen Sequenzierung führt dies zur Identifizierung von Transkripten, die die m5C-Modifikation tragen.

Methylierte RNA-Immunpräzipitierung Assay zur Studie m5C Modifikation bei Arabidopsis

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

methylated-rna-immunoprecipitation-assay-to-study-m5c-modification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

6.5K Aufrufe.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Der methylierte RNA-Immunpräzipitationstest ist eine Antikörper-basierte Methode zur Anreicherung für methylierte RNA-Fragmente. Gekoppelt mit einer tiefen Sequenzierung führt dies zur Identifizierung von Transkripten, die die m5C-Modifikation tragen.

Serie: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

Verfahren zum Messen von RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Änderungen in Zellen und Geweben

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Forschung

Biochemie

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Genetik

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

Antikörperfreier Assay für rna-Methyltransferase-Aktivitätsanalyse

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a variety of human retinal degenerative diseases and pinpoint new treatment approaches. The nuclear architecture of mouse retina is organized in two different patterns: conventional and inverted. Conventional pattern is universal where heterochromatin is localized to the periphery of the nucleus, while active euchromatin resides in the nuclear interior. In contrast, inverted nuclear pattern is unique to the adult rod photoreceptor cell nuclei where heterochromatin localizes to the nuclear center, and euchromatin resides in the nuclear periphery. DNA methylation is predominantly observed in chromocenters. DNA methylation is a dynamic covalent modification on the cytosine residues (5-methylcytosine, 5mC) of CpG dinucleotides that are enriched in the promoter regions of many genes. Three DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) participate in methylation of DNA during development. Detecting 5mC with immunohistochemical techniques is very challenging, contributing to variability in results, as all DNA bases including 5mC modified bases are hidden within the double-stranded DNA helix. However, detailed delineation of 5mC distribution during development is very informative. Here, we describe a reproducible technique for robust immunohistochemical detection of 5mC and another epigenetic DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which colocalizes with the &#34;open&#34;, transcriptionally active chromatin in developing and postmitotic mouse retina.

The objective of this report is to describe the protocol for robust immunohistochemical detection of epigenetic markers, 5-methylcytosine (5mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in developing and postmitotic mouse retina.

Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Entwicklungsbiologie

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Charakterisierung von RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen mittels Massenspektrometrie

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Chemie

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Bestimmung der DNA-Methylierung von geprägten Genen in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Biologie

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Neurowissenschaften

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as epitranscriptomics. Among others, N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C) RNA modifications have been described on mRNA molecules and may have a role in modulating cellular processes. Epitranscriptomics is thus a new layer of regulation that must be considered in addition to transcriptomic analyses, as it can also be altered or modulated by exposure to any chemical or biological agent, including viral infections.
Here, we present a workflow that allows analysis of the joint cellular and viral epitranscriptomic landscape of the m6A and m5C marks simultaneously, in cells infected or not with the human immunodeficiency virus (HIV). Upon mRNA isolation and fragmentation from HIV- infected and non-infected cells, we used two different procedures: MeRIP-Seq, an RNA immunoprecipitation-based technique, to enrich for RNA fragments containing the m6A mark and BS-Seq, a bisulfite conversion-based technique, to identify the m5C mark at a single nucleotide resolution. Upon methylation-specific capture, RNA libraries are prepared for high-throughput sequencing. We also developed a dedicated bioinformatics pipeline to identify differentially methylated (DM) transcripts independently from their basal expression profile.
Overall, the methodology allows exploration of multiple epitranscriptomic marks simultaneously and provides an atlas of DM transcripts upon viral infection or any other cell perturbation. This approach offers new opportunities to identify novel players and novel mechanisms of cell response, such as cellular factors promoting or restricting viral replication.

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in viral infections is just starting to be explored and could highlight new viral-host interaction mechanisms. In this work, we provide a pipeline to investigate m6A and m5C RNA modifications in the context of viral infections.

Erforschung von m6A- und m5C-Epitranskriptomen bei Virusinfektion: ein Beispiel mit HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Methylierte RNA-Immunpräzipitierung Assay zur Studie m⁵C Modifikation bei Arabidopsis

Zusammenfassung

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Verfahren zum Messen von RNA