Este método é significativo porque os modelos organoides derivados do paciente são uma ferramenta poderosa e rápida para estudar o câncer de pâncreas, pois refletem a heterogeneidade genética e fenotípica desta doença. A principal vantagem desta técnica é que os organoides podem ser isolados com uma alta taxa de sucesso de uma quantidade limitada de câncer e eles podem ser expandidos rapidamente in vitro para análise a jusante. Estudar a resposta dos organoides aos medicamentos citotóxicos pode nos ajudar a entender por que os tumores se tornam resistentes à terapia e a definir estratégias de tratamento mais eficazes.
Para iniciar este procedimento, recupere a placa preparada de 12 poços da incubadora. Com um levantador de células estéril, levante suavemente a cúpula extrato de membrana do porão de tal forma que esteja flutuando na mídia completa, certificando-se de evitar raspar o fundo do poço. Usando uma pipeta P1000, transfira cuidadosamente a cúpula BME e a mídia para um tubo cônico de 15 mililitros.
Repita esta etapa para cada poço contendo organoides. Lave suavemente cada poço que foi colhido com um mililitro de mídia basal fria e transfira esta lavagem para o tubo contendo os organoides. Misture bem a solução e os organoides com uma pipeta P1000 e gire a 200 vezes g por cinco minutos.
Uma camada de BME contendo organoides em suspensão e uma pelota organoide aparecerá na parte inferior do tubo. Remova cuidadosamente o supernazio, certificando-se de evitar qualquer perda da camada BME e organoide. Coloque o tubo no gelo.
Adicione 10 mililitros de solução de recuperação de células geladas ao tubo e misture completamente por inversão. Incubar no gelo por 30 minutos enquanto mistura a cada três minutos por inversão. Depois disso, centrífuga a 200 vezes g por cinco minutos.
A pelota organoide deve ser aparente enquanto a camada BME deve ter ido embora. Se a camada BME for reduzida em tamanho, mas ainda visível, incubar por mais 30 minutos a quatro graus Celsius e repetir a centrifugação. Uma vez que o BME tenha sido despolmerizado, remova a solução de recuperação celular, deixando para trás a pelota organoide.
Lave os organoides com 10 mililitros de mídia basal misturando-se com inversão. Centrifugar a 200 vezes g por cinco minutos, remover o supernascedor e colocar o tubo com a pelota organoide no gelo por pelo menos cinco minutos. Opcionalmente, se uma única preparação celular for desejada, adicione três mililitros de trippsina suplementados com 30 microliters de solução DNAse I aos organoides.
Incubar esta reação enzimática a 37 graus Celsius com uma mistura suave de inversão a cada dois minutos por até 10 minutos. Use um microscópio Brightfield para monitorar e confirmar que a dissociação de célula única é bem sucedida. Para parar a reação enzimática, adicione 10 mililitros de mídia basal gelada e gire a 200 vezes g por cinco minutos.
Em seguida, remova o supernaspe. Lave as células com 10 mililitros de mídia basal misturando-se com inversão suave. Centrifugar novamente a 200 vezes g por cinco minutos.
Remova o supernatante e repita este processo de lavagem e centrifugação mais uma vez. Coloque o tubo com a pelota de célula no gelo por pelo menos cinco minutos. Depois disso, adicione BME gelado à pelota celular e use uma pipeta P200 para misturar a solução suavemente até que ela seja homogênea.
Em seguida, coloque a ponta da pipeta perto da parte inferior do tubo e pipeta para cima e para baixo pelo menos cinco a dez vezes para quebrar mecanicamente os organoides. Use uma pipeta P200 para detectar uma cúpula de 100 microliter no centro de um poço de uma placa pré-aquecida de 12 poços. Repita até que toda a solução BME seja dispensada.
Em seguida, transfira cuidadosamente a placa para uma incubadora a 37 graus Celsius para permitir que o gel BME se solidifique. Após 10 minutos, recupere a placa e adicione um mililitro de organoide pré-aquecido em cada poço. As culturas organoides são tipicamente passagens ao longo de sete a dez dias, dependendo da densidade cultural e proliferação.
Se necessário, reponho as culturas com 200 microliters de mídia completa organoide pré-aquecida a cada cinco dias para compensar o esgotamento e a evaporação dos fatores de crescimento. Depois de isolar células únicas de organoides, resuspensar as células únicas em um mililitro de mídia completa organoide humana. Em seguida, use um contador automatizado de células para contar as células certificando-se de registrar a viabilidade celular.
Calcule o número total de células e células viáveis presentes na suspensão de um mililitro. Em seguida, remova o volume equivalente a 400.000 células e transfira-o para um novo tubo. Adicione a mídia completa organoide a este tubo para aumentar o volume até 7,2 mililitros.
Para testes terapêuticos, prepare as células para o revestimento misturando 800 microliters de BME com 7,2 mililitros de mídia completa organoide contendo as células no gelo. Transfira a mistura para um reservatório mantido no gelo e use uma pipeta de 12 canais para a placa de 20 microliters desta mistura em cada poço de uma placa de 384 poços, resultando em aproximadamente 1.000 células sendo banhadas por poço. Em seguida, gire a placa a 100 vezes g por um minuto em um balde de balanço e coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecido a 37 graus Celsius.
Após 24 horas, use um microscópio Brightfield para verificar a presença de organoides. Neste estudo, o organoide PDAC derivado do paciente é isolado, ampliado e caracterizado. Para ilustrar os desafios associados aos organoides isolantes do PDAC, uma cultura organoide representativa derivada do paciente é estabelecida a partir de uma pequena amostra de tumor hipocelular.
Os organoides podem crescer mais ao longo de duas semanas e são aprovados de acordo com o protocolo para estabelecer uma cultura mais robusta. Células únicas de um organoide PDAC representativo estabelecido e de rápido crescimento são então preparadas para demonstrar o resultado do protocolo de farmacoteping. 1.000 células viáveis são banhadas em cada poço e permitidas a recuperação durante um período de 24 horas antes que os agentes citotóxicos quimioterápicos sejam dosados.
Um ensaio de dose 9.0 é realizado em triplicado começando com uma dose baixa de 100 picomolar e terminando com uma alta dose de dois micromolar. Após cinco dias de tratamento, fotos representativas são tiradas para poços tratados com o veículo e com a alta dose de cada agente quimioterápico. Imediatamente após tirar as fotos, a viabilidade celular é avaliada usando reagente de viabilidade celular luminescente e plotada usando software de gráfico.
Organoides derivados do paciente podem ter morfologias heterogêneas. Por isso, é importante otimizar as dissociações enzimáticas para cada cultura. A análise a jusante dos modelos derivados do paciente geralmente envolve o sequenciamento da próxima geração do DNA e do RNA.
Se possível, valide as características moleculares dos modelos utilizando amostras de tecido primário. Culturas organoides individualizadas abrem a possibilidade de abordagens personalizadas de medicina para pacientes com câncer de pâncreas. Lembre-se que produtos químicos perigosos, como fenol-clorofórmio e agentes quimioterápicos, devem ser tratados com EPI e equipamentos de segurança adequados.
