A sonda CFDA amplamente utilizada, ou abreviação de diacetato de carboxyfluorescein, não é fluorescente. Os dois grupos H3 e a posição de 3'6'' neste composto tornam-no membrana-permeante. Quando uma vez dentro das células, os acetatos celulares internos removerão os grupos de acetatos e liberarão a nova forma de CFDA.
Isso é um carboxyfluorescein, ou o CF, que é fluorescente. E como essa nova forma é menos permeante de membrana, o peso, todas as células é mover-se através dos poros intercelulares, ou a plasmodesmaata nas plantas, que está fazendo deste diacetato a sonda ideal para estudar o transporte intercelular na atividade phloem. No vídeo de hoje, vamos demonstrar o CFD carregando na raiz e hipocotyl das plantas arabidopsis, respectivamente, e mostraremos como os dois procedimentos ligeiramente diferentes afetarão o movimento inferior ao topo desta sonda fluorescente.
Alcançar resultados de coloração de forma consistente, armazenamos as sementes de Arabidopsis colhidas em quatro graus Celsius, armário de 40% de umidade. As sementes recém-colhidas armazenadas nesta condição por mais de sete dias são prontamente utilizadas para a semeadura. Para garantir que cada planta seja cultivada em um espaço relativamente semelhante na placa de Petri, estamos usando um cartão de grau de zona de sementes.
Agora, molhando a ponta esterilizada, mergulhe nas sementes esterilizadas, e semeie as sementes um a um na posição designada. Depois de terminar a semeadura, selar a placa de Petri com parafilm e uma fita adesiva, colocá-los em uma caixa de placa de Petri para deixá-lo crescer verticalmente. Aqui estão as ferramentas que vamos usar neste experimento.
Por favor, note que é melhor carregarmos o corante o mais rápido possível. Normalmente, você termina todo o processo em 10 a 15 minutos. Antes de realizarmos o experimento de carregamento CFDA, sempre preparamos uma nova solução CFDA.
Aqui, diluir o CFDA de um milimão em cinco concentrações de micromolar com água antes de usar imediatamente. Corte o parafilm em pequenos pedaços em três por três milímetros de tamanho. Como há condensação na tampa e no fundo da placa de Petri, precisamos limpá-los com papel toalha para evitar que o corante flua ao redor.
Uma pequena peça de parafilm é colocada sob a raiz. Levante as plantas e coloque-as na tampa. Corte as raízes cerca de 5 a 10 milímetros abaixo do hipocótel.
Pegue as filmagens de volta nos pequenos pedaços de parafilm. Agora aplique cuidadosamente um CFDA microliter na extremidade de corte da raiz. Tente evitar contaminar todas as proto-plantas.
Em seguida, cubra a tampa e deixe-as na sala de crescimento por duas horas. O Método hipocotyl-beliscando. A pequena peça de parafilme, como previamente preparado, é colocada sob a junção raiz-hipocotílico.
Usamos um forecep para beliscar suavemente o hipocóclida perto do tecido radicular, e aplicar cuidadosamente 0,1 microliter CFDA no lado apertado e deixar a planta por duas horas. As fotos de nove a 12 dias após as plantas de coloração da zona. Todos eles mostram o padrão de coloração vascular tanto nos cotilledons quanto nas folhas verdadeiras.
Apenas em um caso muito raro, a folha de cotilledon mostrou um padrão de coloração de meia folha. Então, basicamente, os dois métodos não fizeram diferença no padrão de coloração cf, no entanto, se realizarmos o carregamento de corante em cada vez mais plantas, descobrimos que os dois procedimentos dão uma diferença significativa na eficiência. Com o método de corte de raízes, cerca de 70% das plantas mostram o sinal fluorescente na filmagem.
Mas a eficiência pode ser aumentada para 91% usando o método de beliscar hipocotyl. Também tentamos o método de beliscar raízes, mas esse método resulta na eficiência ainda menor, é de cerca de 30% Portanto, parece que a maneira de carregar o corante não explica a diferença de coloração. A diferença provavelmente está nos locais de carregamento, que podem ser separados por uma barreira simplástica.
Mostramos como colocamos o CFDA nas raízes arabidopsis e hipocotyl. Usamos dois procedimentos ligeiramente diferentes, e estes dois procedimentos ligeiramente diferentes resultam em diferença significativa neste movimento inferior para o topo da sonda. Sugerimos que este método poderia nos ajudar a identificar uma potencial barreira siplástica para sinais de tiro derivados de raízes.
