La sonda ampliamente utilizada CFDA, o abreviatura de diacetato de carboxicfluoresceína, no es fluorescente. Los dos grupos H3 y la posición de 3'6' en este compuesto lo hacen permeante de membrana. Donde una vez dentro de las células, los acetatos celulares internos eliminarán los grupos de acetato y liberarán la nueva forma de CFDA.
Eso es una carboxifluoresceína, o el CF, que es fluorescente. Y debido a que esta nueva forma es menos permeante de membrana, el peso, todas las células son para moverse a través de los poros intercelulares, o los plasmodesmatas en las plantas, que está haciendo de este diacetato la sonda ideal para estudiar el transporte intercelular en la actividad phloem. En el video de hoy, vamos a demostrar la carga cfD en la raíz y el hipocotilo de las plantas de Arabidopsis, respectivamente, y vamos a mostrar cómo los dos procedimientos ligeramente diferentes afectarán el movimiento de abajo a arriba de esta sonda fluorescente.
Logramos resultados de tinción consistentemente, almacenamos las semillas de Arabidopsis cosechadas en cuatro grados Celsius, 40% gabinete de humedad. Las semillas recién cosechadas almacenadas en esta condición durante más de siete días se utilizan fácilmente para la siembra. Para garantizar que cada planta se cultiva en un espacio relativamente similar en el plato Petri, estamos usando una tarjeta de calidad de zona de semillas.
Ahora, mojando la punta esterilizada, sumérgete en las semillas esterilizadas y siembra las semillas una por una en la posición designada. Después de terminar de sembrar, sellar el plato de Petri con parafilm y una cinta adhesiva, ponerlos en un soporte de petri para dejarlo crecer verticalmente. Estas son las herramientas que vamos a usar en este experimento.
Tenga en cuenta que será mejor que carguemos el tinte lo más rápido que podamos. Normalmente, termina todo el proceso en 10 a 15 minutos. Antes de realizar el experimento de carga CFDA, siempre preparamos una solución CFDA fresca.
Aquí, diluir el CFDA de un milimolar en cinco concentraciones micromolares con agua antes de su uso inmediato. Corta el parafilm en trozos pequeños en tres por tres milímetros de tamaño. Debido a que hay condensación en la tapa y la parte inferior de la placa Petri, tenemos que limpiarlos con una toalla de papel para evitar que el tinte fluya alrededor.
Una pequeña pieza de parafilm se coloca bajo la raíz. Levante las plantas y colóquelas en la tapa. Corta las raíces de cinco a 10 milímetros por debajo del hipocotilo.
Tome los brotes de nuevo en los pequeños trozos de parafilm. Ahora aplique cuidadosamente un microlitro CFDA en el extremo de corte de la raíz. Trate de evitar contaminar todas las protoplantas.
Luego cubra la tapa y luego déjelas en la sala de crecimiento durante dos horas. El método de hipocotilo-pinching. La pequeña pieza de parafilm, como se preparó previamente, se coloca debajo de la unión raíz-hipocotilo.
Usamos un forecep para pellizcar suavemente el hipocotilo cerca del tejido radicular, y aplicamos cuidadosamente 0.1 microlitr CFDA en el lado pellizcado y dejar la planta durante dos horas. Las fotos de nueve a 12 días después de la zona de tinción de plantas. Todos muestran el patrón de tinción vascular tanto en los cotiledones como en las hojas verdaderas.
Sólo en un caso muy raro, la hoja de cotiledones mostró un patrón de tinción de media hoja. Así que básicamente, los dos métodos no hicieron una diferencia en el patrón de tinción DE CF, sin embargo, si realizamos la carga de tinte en más y más plantas, encontramos que los dos procedimientos dan un acuerdo de diferencia significativa en eficiencia. Con el método de corte de raíz, alrededor del 70% de las plantas muestran la señal fluorescente en el brote.
Pero la eficiencia se puede aumentar al 91%utilizando el método de hipocotilo-pinching. También probamos el método de pellizcar la raíz, pero este método resulta en la eficiencia aún menor, es alrededor de 30%Por lo tanto, parece que la manera de cargar el tinte no tiene en cuenta la diferencia de tinción. La diferencia probablemente radica en los sitios de carga, que podrían estar separados por una barrera simplástica.
Mostramos cómo cargamos el CFDA en las raíces de Arabidopsis y el hipocotilo. Usamos dos procedimientos ligeramente diferentes, y estos dos procedimientos ligeramente diferentes resultan en una diferencia significativa en este movimiento de la sonda de abajo a la parte superior. Sugerimos que este método podría ayudarnos a identificar una posible barrera silásica para las señales de disparo derivadas de la raíz.
