Isolar os miócitos atrial para uso em experimentos de grampo de remendo avançou muito nosso conhecimento e compreensão da eletrofisiologia atrial nos níveis celular e molecular. A abordagem que usamos produz efetivamente um grande número de miócitos atrial isolados que podem ser usados para investigar eletrofisiologia atrial celular e arritmogênese em uma ampla gama de modelos e condições experimentais. Adotamos uma abordagem de digestão do tronco para isolar miócitos atrial.
A vantagem dessa abordagem é que permite ao pesquisador escolher a região específica que deseja investigar. Inicie este procedimento com a elaboração de equipamentos e soluções conforme descrito no protocolo de texto. Coloque a placa de dissecação, ferramentas de dissecação, uma pipeta Pasteur, e as pipetas polidas de fogo.
Este protocolo pode ser realizado em camundongos machos ou fêmeas do tipo selvagem, camundongos portadores de mutações genéticas e modelos de doenças de camundongos. Seguindo a eutanásia do rato, como descrito no protocolo de texto, coloque o mouse em uma toalha de papel ou uma placa de cortiça e tape as patas para baixo para segurar o mouse no lugar. Molhe o baú do mouse com 70% de etanol.
Remova a pele e a pele que cobrem o peito usando uma tesoura curvada. Em seguida, use fórceps de dentes de rato para levantar o esterno e, em seguida, cortar o diafragma ao longo da borda das costelas. Remova toda a caixa torácica usando uma tesoura curva para expor o coração.
Para remover o apêndice atrial, levante suavemente o apêndice usando fórceps de dissecação fina e corte-o com uma tesoura de mola. Transfira imediatamente o apêndice atrial para um prato de dissecação revestido de silício contendo 20 mililitros da solução de pH 7.4 de Tyrode modificada aquecida. Coloque um pino de dissecação na parte superior e um pino na parte inferior da abertura do apêndice atrial.
Usando uma pipeta Pasteur, lave a atria com a solução de pH 7.4 modificada modificada para remover o sangue. Abra o apêndice atrial cortando ao longo de sua borda superior e inferior. Em seguida, fixar os cantos do apêndice atrial para baixo para criar um pedaço de tecido retangular plano.
Corte o apêndice atrial em aproximadamente oito a 10 tiras de tamanho igual usando tesouras de mola e fórceps finos. Observe que as tiras contraem uma vez que são cortadas livre do pedaço principal do tecido. Usando a pipeta polida de fogo pequeno, transfira as tiras de tecido para o primeiro tubo contendo a solução de pH 6.9 modificada aquecida.
Espere cinco minutos. Agora, use a pipeta polida de fogo médio para transferir as tiras de tecido para o tubo de fundo redondo segundo round contendo a solução de pH 6.9 modificada de Tyrode. Para lavar as tiras de tecido, tampe o tubo redondo de cinco mililitros e inverta suavemente o tubo três vezes.
Deixe as tiras de tecido se acomodarem na parte inferior do tubo antes de transferir as tiras de tecido para o terceiro tubo usando a pipeta polida de fogo médio. Lave as tiras novamente por inversão. Em seguida, transfira as tiras de tecido para a solução enzimápica usando uma pipeta polida de fogo médio e incubar por 30 minutos.
Gire o tubo a cada três ou cinco minutos para evitar que as tiras de tecido se adusem. No início da digestão enzimática, as tiras de tecido se instalam rapidamente após o redemoinho. Com aproximadamente 20 minutos de digestão, as tiras de tecido começam a flutuar na solução enzimática após o redemoinho.
Durante esse tempo, as tiras de tecido atrial também mudam na aparência de rosa pálido para branco à medida que são digeridos. Após a digestão enzimática, realize três lavagens usando 2,5 mililitros de solução KB nos tubos redondos de fundo redondo preparados de cinco mililitros. Para cada lavagem, inverta suavemente o tubo três vezes antes de mover o tecido para o próximo tubo usando a pipeta polida de fogo médio.
Após a lavagem final, transfira as tiras para o tubo redondo de fundo redondo de 14 mililitros contendo 2,5 mililitros de solução KB. Espere cinco minutos. Triturar suavemente o tecido por 7,5 minutos usando a pipeta polida de fogo largo.
Isso dissociará mecanicamente as tiras de tecido e produzirá uma solução nebulosa cheia de miócitos atrial individuais. A primeira da trituração deve ser adaptada para produzir um grande número de células sem danos às células. Considere fatores como a idade dos camundongos e a condição da doença.
Adapte a força da trituração ao isolamento individual alterando a frequência e a velocidade de expulsão das tiras de tecido da pipeta polida de fogo largo. A trituração suave resulta em um baixo rendimento celular, enquanto a trituração dura produzirá muitas células mortas. Encha o tubo de fundo redondo de 14 mililitros contendo as tiras de tecido triturado com solução KB para um volume final de sete a dez mililitros, dependendo da densidade desejada das células para uso experimental.
Coloque este tubo em temperatura ambiente por uma hora. Após este período de incubação, as células podem ser usadas para uma variedade de experimentos por até sete horas. Aqui são exemplos de miócitos atrial isolados de camundongos normais.
Miócitos atrial isolados são tipicamente na ordem de 100 mícrons de comprimento e 10 mícrons de largura com estrias claras. A capacitância de miócitos atrial isolados é tipicamente de 40 a 70 picofarads. Um exemplo de um potencial de ação de miócito atrial registrado usando a técnica perfurada de grampo de remendo no modo de fixação atual é mostrado.
Uma família representativa de correntes de sódio foi registrada em toda a configuração celular da técnica de grampo de remendo. Estas correntes foram registradas utilizando-se 50 passos de retenção de tensão de 50 milissegundos entre 100 negativos e 10 milivolts positivos de um potencial de exploração de 120 milivolts negativos. Uma relação de tensão de corrente de sódio sumária é apresentada aqui.
Uma família representativa de correntes de cálcio foi registrada utilizando 250 passos de grampo de tensão de milissegundo entre 60 negativos e 80 milivolts positivos de um potencial de exploração de 70 milvolts negativos. Uma relação de tensão de corrente de cálcio sumária é exibida aqui. Uma família representativa de correntes de potássio foi registrada a partir de um potencial de exploração de 80 milivolts negativos usando 500 milissegundos passos de tensão entre 120 milivolts negativos e 80 milivolts positivos.
Aqui a relação de tensão de corrente de resumo é mostrada para corrente total de potássio. É importante lembrar que um isolamento de miócito atrial bem sucedido depende tanto de uma digestão enzimática adequada quanto da dissociação mecânica das células durante a trituração. Uma vez isolados, os miócitos atrial podem ser usados em experimentos de grampo de remendo para as medidas de morfologia potencial de ação e correntes iônicas, como correntes de sódio, correntes de cálcio e correntes de potássio.
Investigar mudanças na eletrofisiologia do miócito atrial tem sido essencial para determinar a base celular e molecular de arritmias atrial que ameaçam a vida e para o desenvolvimento e teste de compostos anti-arrítmicos para arritmias atrial.
