Aislar los miocitos auriculares para su uso en experimentos de patch-clamp ha avanzado en gran medida nuestro conocimiento y comprensión de la electrofisiología auricular a nivel celular y molecular. El enfoque que utilizamos efectivamente produce un gran número de miocitos auriculares aislados que se pueden utilizar para investigar la electrofisiología auricular celular y la arritmogénesis en una amplia gama de modelos experimentales y condiciones. Hemos adoptado un enfoque de digestión troncal para aislar miocitos auriculares.
La ventaja de este enfoque es que permite al investigador elegir la región específica que desea investigar. Comience este procedimiento con la preparación de equipos y soluciones como se describe en el protocolo de texto. Corte la placa de disección, las herramientas de disección, una pipeta Pasteur y las pipetas pulidas al fuego.
Este protocolo se puede realizar en ratones de tipo salvaje masculinos o femeninos, ratones portadores de mutaciones genéticas y modelos de ratón de enfermedad. Después de la eutanasia del ratón como se describe en el protocolo de texto, coloque el ratón sobre una toalla de papel o una tabla de corcho y pegue las patas hacia abajo para mantener el ratón en su lugar. Humedezca el pecho del ratón con 70%etanol.
Retire el pelaje y la piel que cubre el pecho con tijeras curvas. A continuación, utilice fórceps de diente de rata para levantar el esternón y luego corte el diafragma a lo largo del borde de las costillas. Retire toda la caja torácica con tijeras curvas para exponer el corazón.
Para retirar el apéndice auricular, levante suavemente el apéndice con fórceps de disección fina y córtelo con tijeras de resorte. Transfiera inmediatamente el apéndice auricular a un plato disección recubierto de silicio que contenga 20 mililitros de solución de pH 7.4 modificada calentada. Coloque un pasador de disección en la parte superior y un pasador en la parte inferior de la abertura del apéndice auricular.
Con una pipeta Pasteur, enjuague las aurículas con la solución de pH 7.4 de Tyrode modificada para extraer la sangre. Abra el apéndice auricular cortando a lo largo de su borde superior e inferior. A continuación, ancle las esquinas del apéndice auricular hacia abajo para crear una pieza rectangular plana de tejido.
Corte el apéndice auricular en aproximadamente ocho a 10 tiras de igual tamaño usando tijeras de resorte y fórceps finos. Tenga en cuenta que las tiras se contraen una vez que se cortan libres de la pieza principal de tejido. Con la pipeta pulida de fuego de diámetro pequeño, transfiera las tiras de tejido al primer tubo que contiene la solución de pH 6.9 de Tyrode modificada calentada.
Espera cinco minutos. Ahora, utilice la pipeta pulida contra fuego de diámetro medio para transferir las tiras de tejido al tubo de fondo redondo de la segunda ronda que contiene la solución de pH 6.9 modificada de Tyrode. Para lavar las tiras de tejido, tapone el tubo de fondo redondo de cinco mililitros e invierta suavemente el tubo tres veces.
Deje que las tiras de tejido se asienten en la parte inferior del tubo antes de transferir las tiras de tejido al tercer tubo utilizando la pipeta pulida de fuego de agujero medio. Lave las tiras de nuevo por inversión. A continuación, transfiera las tiras de tejido a la solución enzimática utilizando una pipeta pulida al fuego de diámetro medio e incubar durante 30 minutos.
Gire el tubo cada tres a cinco minutos para evitar que las tiras de tejido se adhiern juntas. Al comienzo de la digestión enzimática, las tiras de tejido se asientan rápidamente después del remolino. A los aproximadamente 20 minutos de digestión, las tiras de tejido comienzan a flotar en la solución enzimática después del remolino.
Durante este tiempo, las tiras de tejido auricular también cambian en apariencia de rosa pálido a blanco a medida que se digieren. Después de la digestión enzimática, realice tres lavados utilizando 2,5 mililitros de solución de KB en los tubos de fondo redondos de cinco mililitros preparados. Para cada lavado, invierta suavemente el tubo tres veces antes de mover el tejido al siguiente tubo utilizando la pipeta pulida de fuego de diámetro medio.
Después del lavado final, transfiera las tiras al tubo de fondo redondo de 14 mililitros que contiene 2,5 mililitros de solución KB. Espera cinco minutos. Triturar suavemente el tejido durante 7,5 minutos utilizando la pipeta pulida en llamas de diámetro ancho.
Esto disociará mecánicamente las tiras de tejido y producirá una solución turbia llena de miocitos auriculares individuales. La primera de la trituración debe ser diseñada para producir un gran número de células sin dañar las células. Considera factores como la edad de los ratones y la enfermedad.
Adapte la fuerza de la trituración al aislamiento individual alterando tanto la frecuencia como la velocidad de expulsión de las tiras de tejido de la pipeta pulida contra el fuego de diámetro ancho. La trituración suave da como resultado un bajo rendimiento celular, mientras que la trituración dura producirá muchas células muertas. Llene el tubo de fondo redondo de 14 mililitros que contiene las tiras de tejido trituradas con solución KB a un volumen final de siete a 10 mililitros dependiendo de la densidad deseada de las células para uso experimental.
Coloque este tubo a temperatura ambiente durante una hora. Después de este período de incubación, las células se pueden utilizar para una variedad de experimentos durante un máximo de siete horas. Aquí se muestran ejemplos de miocitos auriculares aislados de ratones normales.
Los miocitos auriculares aislados suelen estar en el orden de 100 micras de longitud y 10 micras de ancho con estrías claras. La capacitancia de los miocitos auriculares aislados suele ser de 40 a 70 picofarads. Se muestra un ejemplo de un potencial de acción de miocito auricular registrado utilizando la técnica de abrazadera de parche perforada en el modo de abrazadera actual.
Se registró una familia representativa de corrientes de sodio en toda la configuración celular de la técnica de la abrazadera de parches. Estas corrientes se registraron utilizando pasos de abrazadera de voltaje de 50 milisegundos entre 100 negativos y 10 milivoltios positivos de un potencial de retención de 120 milivoltios negativos. Aquí se presenta una relación de voltaje de corriente sódica resumida.
Se registró una familia representativa de corrientes de calcio utilizando pasos de abrazadera de voltaje de 250 milisegundos entre 60 negativos y 80 milivoltios positivos de un potencial de retención de 70 milivoltios negativos. Aquí se muestra una relación de voltaje de corriente de calcio resumida. Se registró una familia representativa de corrientes de potasio a partir de un potencial de retención de 80 milivoltios negativos utilizando pasos de abrazadera de voltaje de 500 milisegundos entre 120 milivoltios negativos y 80 milivoltios positivos.
Aquí se muestra la relación de voltaje de corriente de resumen para la corriente total de potasio. Es importante recordar que un aislamiento exitoso de miocitos auriculares depende tanto de una digestión enzimática adecuada como de la disociación mecánica de las células durante la trituración. Una vez aislados, los miocitos auriculares se pueden utilizar en experimentos de abrazadera de parche para las mediciones de la morfología potencial de acción y las corrientes iónicas, como corrientes de sodio, corrientes de calcio y corrientes de potasio.
La investigación de los cambios en la electrofisiología de miocitos auriculares ha sido esencial para determinar la base celular y molecular de las arritmias auriculares potencialmente mortales y para el desarrollo y prueba de compuestos antiarrítmicos para arritmias auriculares.
