Este protocolo de um modelo de doença que você vê a infecção pelo vírus da dengue no cérebro se torna uma plataforma in vivo para triagem de vetores virais e hospedeiros associados à neuropagênese. Ao contrário dos modelos anteriores, nossos modelos usam ferramentas da infecção com um baixo título viral, para infectar o Instituto de Pesquisa do Câncer imunocompetente amamentando camundongos para indução de procriação de doenças encefálicas. Demonstrando o procedimento será Ting-Jing Shen, um candidato a doutorado do meu laboratório.
Antes de iniciar o procedimento de infecção, diluir o vírus da dengue não adaptado dois estoques, para uma vezes 10 para a quinta placa formando unidades por 40 microliters de RPMI 1640 concentração média. Em seguida, carregue uma seringa de 0,3 mililitro equipada com uma agulha calibre 30 com 10 microliters de vírus diluído. E uma seringa de 0,3 mililitros equipada com uma agulha calibre 30, com 30 microliters de vírus por animal.
Para a entrega intercerebral do vírus, pressione o oráculo entre o polegar e o dedo indicador para conter suavemente um rato do Instituto de Pesquisa do Câncer de sete dias em posição propensa e injetar o volume de 10 microliteres de vírus diluído na área lambda, na intersecção da sutura sagital e lambdoid. Após a injeção intercerebral, use o polegar e o dedo indicador para segurar o rato em uma posição supina, e suavemente intraperitonealmente, injete o volume de 30 microliter do vírus diluído, no abdômen murino. Para a pontuação da progressão da doença, atribua uma pontuação de zero a cinco para cada camundongo inoculado diariamente, de acordo com o grau de doenças semelhantes à encefalite viral aguda, e plote os escores para cada dia como uma figura baseada em curva, utilizando a média mais e menos o desvio padrão dos escores diários de teste em cada grupo.
Em comparação com as mudanças de peso corporal medidas em camundongos simulados, médios apenas inoculados, os animais inoculados pelo vírus da dengue apresentam uma diminuição do peso corporal em todos os momentos durante o ensaio. Além disso, os animais infectados pelo vírus da dengue demonstram um aumento significativo nas posturas de coluna, convulsões límbicas, fraqueza límbica, paralisia e morte em comparação com os sintomas apresentados por animais simulados inoculados. De fato, camundongos infectados pela dengue apresentam uma redução temporal dependente das taxas de sobrevivência que não é observada em animais inoculados simulados, confirmando o estabelecimento de um modelo infeccioso de vírus da dengue dentro do sistema nervoso central que demonstra a progressão de doenças semelhantes à encefalite viral aguda em camundongos.
A punção do local errado pode resultar em bloqueio de agulhas pelo escore e o estouro da solução do vírus fora da cabeça, resultando em injeção falhada e uma infecção falha. Após o procedimento, amostras cerebrais podem ser colhidas para danos patológicos, infiltração de células imunes e análise de replicação viral por citometria de fluxo de hematoxilina e eosina, e ensaio de formação de placa, respectivamente. Nosso modelo murine imunocompetente fornece uma plataforma para explorar os mecanismos patogênicos da infecção pelo vírus da dengue, para o desenvolvimento de vacinas contra o vírus da dengue, ou drogas anti-dengue.
O vírus da dengue é um patógeno de nível dois de biossegurança, e, como tal, todos os experimentos com esse vírus devem ser concluídos em um laboratório de biossegurança animal qualificado nível dois.
