Este protocolo permite o estudo da iniciação e desenvolvimento de respostas neuroinflamatórias no sistema nervoso periférico do camundongo durante uma infecção viral. Com esse modelo, as infecções percorrem uma maior distância da periferia até o sistema nervoso periférico e central, permitindo uma avaliação máxima da cinética da resposta neuroinflamatória. Depois de colocar o rato C57BL/6 anestesiado de cinco a sete semanas na posição supina em uma almofada cirúrgica, confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal.
E use uma tábua de 100 a 180 grãos, para suavemente abrade a pele glabrous de um footpad traseiro entre o calcanhar e almofadas de caminhada com cerca de 20 passes da placa. Em seguida, use fórceps finos para lentamente descascar o estrato corneum destacado pela abrasão para expor o basale estrato. Após uma mistura suave, aplique topicamente 20 microliters do titer apropriado do inóculo do vírus no footpad abraded.
Realizar inoculações simuladas com meio apenas nos blocos de pé abrasados dos animais de controle em paralelo. Após cada aplicação, esfregue suavemente o footpad 10 vezes com o eixo de uma agulha para facilitar a adsorção do vírus a cada 10 minutos por 30 minutos. Quando o bloco de pé abrasado estiver seco, permita que os camundongos se recuperem com monitoramento até a recumbência severa antes de colocar os animais em gaiolas individuais para acompanhamento clínico e amostragem.
Nos pontos de tempo experimentais apropriados, colete os órgãos expostos do vírus, incluindo coração, pulmões, baço, pâncreas, fígado, rins e bexiga em microtubos individuais de 1,5 mililitro no gelo. Em seguida, colde os footpads abrasados entre o calcanhar e as almofadas de caminhada e coloque as amostras em microtubos individuais de 1,5 mililitro no gelo. Em seguida, coloque o mouse na posição propensa e molhe a pele com 70% de etanol.
Para expor a coluna vertebral, faça uma pequena incisão na região da pelve e retire a pele dos membros traseiros em direção à cabeça. Para remover os membros da frente e do traseiro, use uma tesoura para cortar paralelamente e perto da coluna vertebral de ambos os lados. E remova a cabeça na base do crânio.
Use a tesoura para abrir o crânio do forame magnum até o osso frontal. E use fórceps para abrir o crânio em uma direção lateral. Em seguida, use os fórceps para colher suavemente o cérebro e colocar o cérebro em um microtubo de 1,5 mililitro no gelo.
Use uma tesoura curva para limpar a coluna vertebral do músculo, gordura e tecido mole, e remova a cauda. Em seguida, coloque a coluna vertebral intacta em um tubo de 15 mililitros de PBS gelado estéril no gelo por não mais do que três horas. Após a dissecção, transfira a medula espinhal para um prato de cultura tecidual para permitir a remoção de qualquer tecido mole restante.
Use uma lâmina de barbear para fazer três cortes transversais através da coluna vertebral nas vértebras S2, L1 e T1. Transfira as peças em pratos individuais de 15 milímetros contendo PBS estéreis gelados. Acompanhar e marcar as origens dos segmentos para análise posterior.
Em seguida, use fórceps para fixar um lado dorsal do segmento para cima e use uma lâmina de barbear para fazer um único corte longitudinal através da linha média para dividir a coluna em duas metades iguais. Coloque ambas as metades em uma nova placa de Petri contendo PBS fresco e estéril na orientação original para ser capaz de distinguir os lados esquerdo e direito da coluna vertebral. Sob um microscópio dissecador, use fórceps finos para descascar suavemente a medula espinhal de cada metade da coluna vertebral em uma direção rostral para caudal.
Em seguida, coloque ambas as metades da medula espinhal em microtubos individuais de 1,5 mililitro contendo 500 microliters de PBS gelado estéril no gelo. Para expor o gânglio raiz dorsal, remova suavemente as meninges de um lado da coluna vertebral para o outro. E puxe o nervo espinhal branco exposto para fora da coluna vertebral.
Retire o gânglio de raiz dorsal redondo e transparente do segmento da coluna vertebral em uma placa de Petri de 15 milímetros de PBS gelado. E coletar o gânglio raiz dorsal ipsilateral e contralateral como apenas demonstrado. Depois de colher o nervo espinhal e o gânglio raiz dorsal dos outros dois segmentos da coluna vertebral como apenas demonstrado, centrifugar todos os tubos de tecido em alta velocidade.
Em seguida, aspire os supernantes e congele as amostras em nitrogênio líquido, e armazene a menos 80 graus Celsius até a homogeneização. Para homogeneização tecidual, descongele os tubos de tecido congelado no gelo antes de pesar 100 miligramas de cada amostra. Transfira para um tubo de microcentrifuuge de dois mililitros contendo contas estéreis e 500 microliters de tampão de ensaio radioimmunoprecipitação.
Em seguida, interrompa os tecidos à temperatura ambiente em um homogeneizador a 20 ciclos por segundo durante dois minutos, seguido por um período de espera de um minuto e 20 ciclos por segundo por mais dois minutos. Após a segunda rodada de homogeneização, centrifugar os tecidos em alta velocidade antes de transferir 500 microliters de cada supernante para um novo tubo apropriadamente rotulado. Armazene a menos 20 graus Celsius até a análise a jusante.
O local de abrasão é visível no bloco de controle. E é típico de uma crosta se formar no local de abrasão como parte do processo de cura. Em contraste, camundongos inoculados com pseudorabies, demonstram uma inflamação grave do footpad no ponto final humano que é caracterizado por inchaço e vermelhidão.
O exame histopatológico do gânglio inoculado e da raiz dorsal revela necrose epidérmica e inflamação dérmica grave dentro das seções de pés infectados por pseudorabies. A infiltração de neutrófilos também é observada em pseudorabies infectados por DRG. Um aumento significativo na expressão proteica G-CSF é medido no footpad e no gânglio raiz dorsal de camundongos infectados por pseudorabies em comparação com os controles em sete e 82 horas após a infecção.
Níveis significativos de G-CSF também são observados em 82 horas após a infecção na medula espinhal, cérebro, coração e tecidos hepáticos de camundongos infectados por pseudorrábies em comparação com os controles. Além disso, níveis significativos de IL-6 são detectados em todos os tecidos testados de camundongos infectados por pseudorabies a partir de 24 horas após a infecção. Em um estado moribundo, pseudorabies foram detectados no footpad, gânglio raiz dorsal, medula espinhal e cérebro.
Com a alta expressão citoplasmática de psuedorabies glycoproteína gB nos neurônios do gânglio raiz dorsal em pseudorabies camundongos infectados. Para garantir uma infecção bem sucedida, é importante que a gota de vírus em uma coluna não caia do footpad abraded. Este modelo animal pode servir de plataforma para testar a eficácia de drogas anti-inflamatórias e antivirais, a fim de prevenir neuropatias periféricas induzidas pelo viral.
