Estudar o microambiente tumoral é difícil devido à sua complexidade. Desenvolvemos microarrays de microambiente que consistem em microambientes combinatórios simples que permitem a identificação de grandes condutores de fenótipos de células tumorais. A maior vantagem da plataforma MEMA é que, como as condições de microambiente são todas definidas, é simples identificar fatores de microambientes que impulsionam fenótipos de interesse.
A plataforma MEMA é amplamente aplicável em outros sistemas não cancerígenos, incluindo cepas de células primárias e células-tronco. Há uma série de truques de engenharia e passos que desenvolvemos para acelerar o trabalho de banco molhado e simplificar o protocolo. Para começar, use uma impressora de pinos de toque para imprimir mistura de impressão de matriz extracelular em pontos fiduciários em placas de oito poços.
Use pinos de diâmetro de 350 micrômetros dispostos em uma configuração de cabeça de impressão quatro vezes sete para imprimir a matriz extracelular para as microarrays de microambientes. O bloco de colágeno é impresso em MEMAs como uma grade. Os poços cheios de PBS fornecem umidade extra para evitar a secagem da placa de origem da mistura de impressão da matriz extracelular.
Imprima as matrizes nas placas de oito poços e 20 colunas por 35 linhas, totalizando 700 pontos. Após a impressão, armazene as placas em um dessecador por um mínimo de três dias antes do uso. Primeiro, projete um layout de placa de 96 poços com espaçamento que permita o uso de uma pipeta multicanal com quatro pontas espaçadas, para que o tratamento de muitas placas MEMA possa ser feito de uma só vez.
Em seguida, recupere os ligantes do congelador, e descongele no gelo em um capô de fluxo laminar. Gire brevemente e gire para baixo cada tubo. Use o buffer recomendado pelo fabricante para diluir os ligantes a um estoque de trabalho 200 vezes.
Pipeta 10 microliters de cada estoque de ligantes 200 vezes no poço correspondente dentro da placa de 96 poços. Use filme de vedação para selar as placas e armazená-las a menos de 20 graus Celsius. Faça placas de tratamento de ligante em lotes e capture todos os metadados para análise a jusante.
Antes de modelar as células, bloqueie os MEMAs com dois mililitros por poço de tampão de bloqueio não-insano por 20 minutos. Use um divisor Y com duas pipetas Pasteur para aspirar o buffer de bloqueio em vários poços ao mesmo tempo e, em seguida, lavar três vezes os poços com PBS. Para evitar a dessecação, deixe o volume final de PBS nos poços até ficar pronto para o revestimento celular.
Antes de um experimento completo de MEMA, otimize a concentração de semeadura de células MCF7 realizando um experimento de titulação celular. Um ponto ideal, como mostrado aqui, tem números de células suficientes para extrair dados, mas não tantos que o local é excessivamente confluente. No MEMA, aspire as células de PBS e sementes restantes mcf7 em 30.000 a 35.000 células por poço em dois mililitros de meio de semeadura.
Coloque o MEMA em uma incubadora a 37 graus Celsius. Após a adesão durante a noite na incubadora, aspire o meio e substitua por dois mililitros de meio de crescimento reduzido para isolar o impacto estimulativo de ligantes específicos. Em seguida, descongele uma placa de tratamento de ligantes previamente congelada no gelo.
Placa desvalada centrífuga a 200 vezes g por um minuto. Transfira 200 microliters de meio de cada poço na placa de cultura MEMA para o poço apropriado na placa de tratamento de ligantes. Pipeta para cima e para baixo para misturar o ligante com o meio, e transferir essa mistura de volta para o poço apropriado na placa de cultura MEMA.
Levemente balançar à mão e devolver as placas MEMA à incubadora para cultivar a combinação ligante-ECM a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 71 horas, adicione 100 vezes o EdU aos poços mema para uma concentração final de 10 micromolar. Incuba-o por mais uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Após a incubação final, aspire os poços. Fixar MEMAs em dois mililitros por poço de 2%PFA por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aspire o PFA dos poços.
Permeabilize com dois mililitros por poço de surfactante noniônico de 0,1% por 15 minutos. Aspire o surfactante e depois lave os poços com dois mililitros de PBS e PBS-T, sequencialmente. Depois disso, adicione 1,5 mililitros de reagentes de reação de detecção de EdU a cada poço.
Incubar por uma hora em temperatura ambiente, balançando e protegido contra a luz. Em seguida, sacie a reação com 1,5 mililitro comercial saciar tampão por poço. Aspire novamente e lave com PBS-T antes de incubar com concentrações otimizadas de manchas ou anticorpos.
Incubar poços MEMA com anticorpos primários no tampão de coloração, balançando a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação primária de anticorpos, lave poços com PBS seguidos de PBS-T. Adicione anticorpos secundários em 0,5 microgramas por DAPI mililitro, diluídos no tampão de coloração.
Incubar, balançando por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Lave poços duas vezes com dois mililitros por poço de PBS, e deixe-os nos dois mililitros finais da PBS. Para a imagem manchada mema, coloque-o no estágio microscópio de um sistema de imagem automatizado com canais de detecção fluorescentes apropriados.
Saída resultante de dados de imagem para um sistema de gerenciamento de imagem. Segmentar células e calcular níveis de intensidade usando CellProfiler. Neste protocolo, os perfis de ciclo celular de valores de intensidade de DAPI binned versus contagem celular de uma placa de oito poços indicam células na fase de ciclo de células G1 versus G2.
Isso corresponde a dois teor de nDNA em células em fase inicial de crescimento, e quatro teor de nDNA em células prestes a sofrer mitose. O impacto do microambiente de ligantes e ECM no número de células e na incorporação da EdU é mostrado. Vermelho indica maior número de células, e azul é menor número de células.
Muitos dos efeitos são orientados por ligantes, uma vez que a condição de ECM não impactou fortemente o número celular ou a positividade da EdU. Natagen 1 é uma clara exceção, pois a presença desta molécula de ECM inibe a ligação celular e o crescimento do MCF7. Ligantes como FGF6 e neuregulina-1 alfa aumentam o número celular e têm altas taxas de incorporação da EdU, enquanto ligantes como a anfiiregulina e neuregulina-1 SMDF inibem a ligação celular e o crescimento das células.
Um exemplo de células MCF7 crescendo em um ponto MEMA tratado com neuregulina-1 alfa mostra altas taxas de incorporação de EdU, indicadas por núcleos cor-de-rosa. Nesta imagem, a mancha verde é máscara celular, e azul é DAPI. Como um experimento mema completo é caro, é muito importante realizar etapas de otimização, como titulações celulares e soros, antes de realizar o experimento completo.
Uma vez identificadas condições microambientais de interesse usando a plataforma MEMA, os ligantes específicos e proteínas de matriz extracelular podem ser estudados com mais profundidade usando sistemas tradicionais de cultura celular 2D e 3D.
