Общая цель этой процедуры заключается в использовании микроскопии в качестве инструмента для изучения фагоцитоза патогенных грибковых видов Cryptococcus neoformans его экологического хищника амебы. В этом видео подробно протокол для подготовки совместной культуры криптококкальных клеток и амеб, которые я буду изучать с помощью конфокальной лазерной микроскопии и электронной микроскопии передачи. Информация, полученная от использования этих методов может пролить понимание поведения криптококкальных клеток при интернализировании во время инфекции.
Streak из теста грибковых штаммов на YPD агар пластин. Инкубировать пластину в течение 48 часов при 30 градусах по Цельсию. Соскречьте петлю клеток из 48-часовой пластины и привить их в 250-миллилитровую коническую колбу, содержащую 100 миллилитров бульона YNB, который дополняется 4%глюкозой.
Инкубировать колбу при 30 градусах по Цельсию в течение 24 часов на роторном шейкере. После 24-часового инкубационный период подсчитайте грибковые клетки с помощью гемоцитометра и отрегулируйте число клеток до одного миллиона клеток на миллилитр с физиологическим буферным раствором. Культивировать амебы клетки в пептон дрожжей экстракт глюкозы бульон в течение недели при 30 градусов по Цельсию.
Подсчитайте клетки амебы с помощью гемоцитометра и отрегулируйте число клеток до 10 миллионов клеток на миллилитр со свежим стерильным ATCC medium 712. После этого, выполнить анализ жизнеспособности с помощью trypan голубое пятно. Целесообразно работать с клетками, которые показывают, по крайней мере 80%жизнеспособности.
Выпредельте 200-микролитровую подвеску стандартизированных клеток амебы в камеры адепта слайда. Разрешить два часа, чтобы пройти для клеток придерживаться поверхности при 30 градусов по Цельсию. В то время как клетки амебы оседают, окрашивают стандартизированные криптококковые клетки фторсхейном изотиоцианатом.
Аккуратно агитировать грибковые клетки в течение двух часов при комнатной температуре и в темноте. Выпределите 200-микролитровую подвеску окрашенных криптококкальных клеток после мытья в соответствующие камеры, которые уже содержат клетки амебы. Инкубировать подготовленную ко-культуру при 30 градусах по Цельсию в течение еще двух часов.
В конце периода coincubation, мыть камеры дважды с PBS, чтобы удалить любые несвязанные клетки амебы, включая не интернализированные криптококковые клетки. Аспирировать глутаралдегид, который был использован, чтобы исправить клетки, и мыть камеру дважды с PBS. Демонтировать камерную горку.
Просмотр совместно культурных клеток с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. В дополнение к вышеупомянутому анализу, пятно криптококкальных клеток с красителем pHrodo, который выборочно позволяет для чтения клеток, оказавшихся внутри пищевой вакуол. Разпределите эти окрашенные клетки в колодцы черной пластины микротитр, которая уже содержит семенами клеток амебы.
Измерьте флуоресценцию на считыватель микроплиты, который может преобразовать логаритмические сигналы в относительные флуоресцентные единицы. Добавьте пять миллилитров стандартизированных криптококкальных клеток в ту же центрифугу, которая уже содержит пять миллилитров стандартизированных клеток амебы. Разрешить трубку стоять в течение двух часов при 30 градусов по Цельсию.
Аспирировать супернатант после центрифугации. Исправить гранулы, которая представляет собой со-культурных клеток с одним моляром фосфата натрия буфера 3%glutaraldehyde при рН 7 в течение трех часов. Вымойте со-культурных клеток один раз с фосфатным буфером натрия.
Исправить снова в течение 1 1 / 2 часа в аналогичным буфером 1%osmium тетроксида следуют стирки. Обезвоживать материал TEM также известный как со-культурных клеток в градуированных ацетон серии 30%50%70%95%и 100% в течение 15 минут каждый. Здесь повторите заключительный шаг обезвоживания в двух изменениях.
Подготовка эпоксидной смолы, взвешивая эпоксидной смолы нормальной консистенции. Вставлять материал в эпоксидную смолу. Полимеризируйте материал TEM в течение восьми часов при 70 градусах Цельсия.
Вырезать 16-нанометровые секции со стеклянными ножами, установленными на ультратоме. Пятно разделов с уранил ацетат в течение 10 минут в темноте следуют свинца цитрат в течение 10 минут, а также в темноте. Просмотр секций с помощью электронного микроскопа передачи.
Для иллюстративных целей, в видео, два изолята рассматриваются, один, который производит 3-гидрокси жирные кислоты, а другой, который не. 3-гидрокси жирные кислоты являются вторичными метаболитов, которые не играют роли в росте криптококкальных клеток. Вот снимки, которые показывают интерактивные моменты между Cryptococcus и amoebae.
В точку, криптококковой ячейки до и после интернализации можно наблюдать. При изучении фагоцитоза, он идеально подходит для использования живой визуализации. Тем не менее, это не всегда возможно для исследователей, чтобы иметь доступ к такому микроскопу для того, чтобы следить за процессом фагоцитоза непрерывно.
Возможным решением для компенсации этого ограничения может быть дополнение изображений количественными данными путем считывания относительных флуоресцентных единиц. График бара является примером данных, которые я использовал в дополнение к изображениям. Важно отметить, что как качественные данные в виде изображений, так и количественные данные могут быть взяты в разные моменты времени в течение времени.
Путем piecing вся информация, одно может начать построить более большое изображение что transpires во время процесса фагоцитоза. Из количественных данных, ясно видеть, что клетки с 3-гидрокси жирных кислот менее восприимчивы к действию амебы по сравнению с клетками, которые не производят 3-гидрокси жирных кислот, как меньше клеток интернализированы. TEM является особенно мощным инструментом, поскольку он может дать с высоты птичьего полета в люмен пищи vacuole из-за его высокого разрешения власти, и это вид деталей, которые часто упустить при изучении живой изображения, а также изображения.
В этом конкретном микрографе TEM отчетливо видны выступы на поверхности криптококкальных клеток. Ранее предполагалось, что эти поверхностные структуры клеток являются каналами, по которым 3-гидрокси жирные кислоты высвобождаются в окружающую среду. В точку, эти каналы могут помочь доставить 3-гидрокси жирных кислот в люмен пищевой вакуол амебы, чтобы изменить внутренние условия, следовательно, содействие выживанию клеток.
pHrodo или как FITC может быть гораздо лучше пятно для использования, как это только флуоресцентный при низком рН, как внутри пищи vacuole. Чтобы быть конкретным, pHrodo только позволяет исследователю получить данные о внутренних клетках. С этой целью важно, чтобы клетки были приостановлены в фосфатных буферных растворов до окрашивания и что амебы средств массовой информации имеет нейтральный рН.
Операторы электронного микроскопа передачи должны быть хорошо обучены правильному разделу, так как это часто точка, где результаты могут быть искажены и микрограф поврежден в результате бомбардировки электронов. Предполагается, что исследователи смогут получить достаточно информации из представленного протокола и оптимизировать их в своих собственных исследованиях. Кроме того, исследователи могут также разрабатывать антитела против целевого метаболита и применять их во время их иммунофторесцентной микроскопии исследования, включая иммуноголд маркировки во время исследования TEM.
