O trabalho aqui apresentado foi apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) (concede DCB-120.266, PPP-133377 e HBF-348967 para AG).

1. Células e transfecções <ol><li> Culturas de células HEK 293T em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. Prepara-se uma suspensão de 2 x 10 5 células / mL no meio de cultura celular. Adicionar 500, 100 e 1.000 mL da suspensão de células a cada poço de 24 poços, 96 poços e 12 poços placas, para a produção virai, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente (Figura 2A). </li><li> Agite suavemente as placas e incubar O / N a 37 ° C com 5% de CO 2. Cultivar células a 50-70% de confluência. </li><li> De acordo com um plano de transfecção, preparar diluições de ARN de teste e os controlos em tubos de 1,5 ml (micro exemplo, a Figura 2B). <ol><li> Para o ensaio de produção viral, preparar uma diluição de 10 ng / ul de um plasmídeo de expressão de HIV-1 e adicionar 10 uL a cada tubo. Próximo preparar 5 uM diluições de ARN de teste e um controlo negativo RNA. Adicionar 2,5 ou 10 ul de cada diluição de ARN de teste e de controlo negativo aos tubos correspondentes para 25 ou 100 nM de concentração final. </li><li> Para o ensaio de viabilidade de células, preparar 5 uM diluições de ARN e um teste de 10 mg / ml de diluição do ARN de controlo positivo, de baixo peso molecular, poli I: C. Adicionar 2 mL de ARN de teste, ou de diluições de ARN controlo positivo para os correspondentes tubos de 100 nM ou 200 ug / ml de concentração final, respectivamente. </li><li> Para o ensaio de activação imunitária, adicionar 20 ul de ARN de teste, ou de diluições de ARN de controlo positivo, preparado no passo 1.3.2. aos tubos correspondentes para 100 nm ou 200 ug / ml de concentração final, respectivamente. Nota: Para os plasmídeos de expressão de ARN de teste, preparar diluições de 10 ng / ul em vez dos 5 uM diluições de ARN de teste, dando quantidades finais de 25 e 100 ng para o passo 1.3.1. e 100 ng para etapas 1.3.2. e 1.3.3. </li></ol></li><li> Adicionam-se 50, 25 ou 75 ul de DMEM a cada tubo de transfecção para prod viralução, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente. Para os ensaios de produção virais, trazem células e tubos de transfecção preparados para a 3 (BSL3) laboratório nível bio-segurança antes da próxima etapa. </li><li> Adicionar 2 ml da sequencialmente reagente de transfecção para os tubos de transfecção e incubar 15 min a 20 para permitir que os complexos de modo a formar. Ver a Tabela de Materiais para o reagente de transfecção específico a ser utilizado. </li><li> Adicionar toda a mistura de transfecção de cada gota a gota, para as posições correspondentes nas placas de cultura de células micro tubo. Agite suavemente e incuba-se as placas durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Meça HIV-1 de produção (seção 2), a viabilidade celular (seção 3) e ativação imune (secção 4) nas placas de cultura de células (Figura 2C). </li></ol> 2. Ensaio de produção virai <ol><li> Remover as placas de cultura celular de 24 poços da incubadora e agitar suavemente as placas no interior da cultura de células BSL3capuz. Transferir 150 ul de sobrenadante de cada poço para um poço correspondente de uma placa de 96 poços de fundo plano, que vai ser utilizado para quantificar a produção de HIV-1. Nota: Os ensaios de quantificação virais mais comuns incluem a medição da expressão da proteína da cãpside de HIV-1 (p24) pelo ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) 20, a quantificação de ARN viral por transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) 21 e medindo a actividade da enzima RT HIV-1. Passos 2.2 a 2.5 explicar métodos para quantificar HIV-1 actividade RT 13,15,16. </li><li> Transferência de 5 ul de sobrenadante para poços correspondentes de uma placa de 96 poços, contendo 25 ul de uma perturbação viral cocktail 15 (Tabela 1). Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente e transferir a placa para uma estação de trabalho radioactividade. Nota: Passo 2.2. só é necessário se uma estação de trabalho de radioactividade que não está disponível no laboratório BSL3. Se as placas não precisam de ser removidos dolaboratório BSL3, vá para o passo 2.3. e adicionar 50 ul de radioactivos / viral cocktail ruptura (Tabela 1) em lugar dos 25 ul de coquetel radioactivos. </li><li> Prepara-se uma radioactivos cocktail 15 (Tabela 1), e adicionar 25 ul a cada poço de sobrenadante viral e cocktail de interrupção. Incubar as placas a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Ponto 5 uL da mistura de reacção sobre quadrados correspondentes de uma fibra de vidro Di Etil amino-etil (DEAE) de papel filtermat e deixar que as gotas para secar durante 10 min. Manchar a mistura de reacção em todos os outros quadrados de modo que não há duas amostras Boarder diretamente um ao outro. Isto ajuda a evitar o cruzamento entre amostras para determinar as contagens por minuto (cpm) no passo 2.6. </li><li> Lavar os papéis 5x durante 5 min com tampão de 2x citrato de sódio salino (SSC) (Tabela 1), seguido por duas lavagens com um mínimo de 95% de etanol. Permitir que os papéis para secar e selá-los em sacos de amostras. </li><li> Clip sacos de amostras containing do papel filtermat em uma fita e insira a cassete em um contador de cintilação de microplacas. Definir o contador para ler cpm de 32 P com a data de referência prevista para o lote de [32 P] dTTP utilizado na experiência. Selecionar quais amostras de ler usando o mapa da placa e iniciar o contador. </li><li> Para qualquer método de quantificação viral, dividir os valores obtidos para cada teste de ARN pelo controlo negativo adjacente e multiplicar este valor por 100 para obter a percentagem de inibição da produção do VIH-1 para cada repetição dos ARN de teste. Um exemplo dos resultados que comparam diferentes RNAs de teste em diferentes concentrações é fornecido na Figura 3. </li></ol> 3. ensaio de viabilidade celular <ol><li> Remover as placas de 96 poços a partir da incubadora e adicionar 20 uL de 5 mg / ml de MTT (brometo de 3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazólio), diluído em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco ( DPBS) a cada poço. Incubar as placas de fou 3 horas a 37 ° C. </li><li> Adicionar 150 uL de isopropanol, acidificado com detergente (1% de NP-40, de HCl 4 mM em isopropanol) a cada poço e incuba-se as placas durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Determinar a absorvância a 570 nm num espectrofotómetro de microplacas. </li><li> Calcular o metabolismo de MTT relativo para cada ARN de controlo e de teste positivo, dividindo o valor obtido para cada amostra pelo seu controlo de transfecção adjacente. Um exemplo dos resultados que comparam diferentes RNAs de teste e um controlo positivo é fornecida na Figura 4. </li></ol> 4. Activação Ensaio Imunológico <ol><li> Remover as placas de 12 poços a partir da incubadora e aspirar o meio de cultura. Lavar suavemente as células duas vezes com DPBS e adicionar 70 ul de tampão de lise frio de 22 (incluindo os inibidores de protease e fosfatase, quadro 1) a cada poço. Incubar as placas durante 10 min em gelo. </li><li> Transferir os lisados ​​celulares para micro tubos e rápido congelá-los por imersão dotubos em azoto líquido. Permitir que as amostras para descongelar e repetir por mais 2 ciclos de congelação descongelação para um total de 3. </li><li> Centrifugar os lisados ​​durante 15 minutos a 4 ° C, 15700 x g, para sedimentar os detritos celulares. Transferir o sobrenadante para novos tubos de micro e determinar a concentração de proteína usando o método de azul de Coomassie (Bradford) 23,24. </li><li> Resolver 75 ug de proteína de cada amostra num gel de poliacrilamida desnaturante a 10% e transferir para uma membrana de nitrocelulose como anteriormente descrito 25,26. </li><li> Após electroforese e transferência para uma membrana, revelam bandas de proteína por incubação da membrana em Ponceau S (Tabela 1) durante 1 min seguido de lavagem em água destilada duas vezes. Use as bandas e escada proteína como um guia para cortar a membrana em 80 e 55 kDa. Nota: No passo 4.4 amostras pode ser executado em 16 x 18 cm 2 géis para baixo a 34 kDa, de modo que é fácil de cortar a membrana nas posições especificadas e não cortar através dabandas de interesse. Alternativamente, vários géis podem ser executados com as mesmas amostras para evitar o corte da membrana. </li><li> Lavar a coloração de Ponceau S com solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween 20 (TBST, Tabela 1). Adicionar TBST com leite não gordo a 5% para cobrir completamente as membranas. Incubam-se as membranas à temperatura ambiente com agitação durante 1 h. </li><li> Incubam-se as membranas de O / N em TBST, com 3% de albumina de soro bovino (BSA) e anticorpos diluídos a 1: 1000 contra ADAR1 (110 e 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), e fosfo-IRF3 (47 kDa), para as peças de topo, meio e inferior da membrana, respectivamente. </li><li> Lavam-se as membranas 5x durante 5 min com TBST e incubar em TBST com 5% de leite sem gordura e os anticorpos secundários anti-coelho de cabra marcado com peroxidase (diluído a 1: 5000) durante 1 h. </li><li> Lava-se a membranas de 5x durante 5 min com TBST e aplicar a solução de electroquimioluminescência (ECL) para visualizar as bandas em películas de acordo as instruções do fabricante. </li><li> Depois de visualizar as bandas de proteína sobre os filmes, lavar as peças do meio e inferior da membrana durante 10 minutos com uma solução de anticorpo de extracção. Incubam-se as membranas de o / n em TBST, com 3% de BSA e anticorpos contra PKR total de (a 1 em 500) e IRF3 (a 1 em 1000), para o meio e pedaços de fundo, respectivamente. Repita os passos 4.8. e 4,9. usando marcado com peroxidase de cabra anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho para a membrana PKR (meio). </li><li> Lava-se a peça de fundo da membrana 5x durante 5 min com TBST e incubar a membrana em TBST, com 3% de BSA durante 1 hora com um anticorpo contra actina (diluído a 1: 5000). Repita os passos 4.8. e 4,9. usando marcado com peroxidase de cabra anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho. Um exemplo de resultados comparando diferentes RNAs de teste e um controlo positivo é fornecido na Figura 5. Veja a Tabela de Materiais para os anticorpos específicos a serem utilizados. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+RRE+RNA+acts+as+an+RNA+silencing+suppressor+by+competing+with+TRBP-bound+siRNAs.">HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs.</a> RNA Biol. 12, 123-135 (2015).</li><li>Castanotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+delivery+of+small+interfering+RNAs+reduces+RNAi+efficacy+by+selective+incorporation+into+RISC.">Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC.</a> Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).</li><li>Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+adaptors+result+in+reduction+of+multiple+pre-mRNA+species+principally+by+sequestering+U1snRNP.">U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP.</a> Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).</li><li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds.">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Riss, T. L., et al., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual. , (2004).</li><li>Reynolds, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+interferon+response+by+siRNA+is+cell+type-+and+duplex+length-dependent.">Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent.</a> Rna. 12, 988-993 (2006).</li><li>Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+or+stimulation?+siRNA+delivery+and+the+immune+system.">Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O ensaio de produção de HIV-1 descrita foi realizada utilizando células HEK293T (Figura 2) e é semelhante para os ensaios utilizados para rastrear ARN de HIV-1 para ribozima eficaz 13, shRNA 10,29, ARNsi 30, e U1i locais de ARN alvo 11,31. Usando diferentes métodos para quantificar a produção de HIV-1, a maioria dos estudos mediram a produção virai de 48 h após a co-transfecção de um plasmídeo de expressão do VIH-1 com RNAs candidatos. Após a produção do VIH-1, os viriões imaturos sofrem clivagem proteolítica dos seus poliproteínas pelo HIV-1 protease para se tornar viriões maduros, capazes de infectar novas células. Para o ensaio da actividade enzimática de RT de HIV-1 descrito nas etapas 2.2. a 2.5., tanto a produção e as etapas de maturação são avaliados, uma vez que a enzima RT só está activo em viriões maduros. Em contraste, a proteína da cápside virai e ARN podem estar presentes em ambos os viriões maduros e imaturos. Portanto, quantificar a produção do VIH-1 por ELISA p24 ou RT-PCR may perca efeitos de ARN terapêuticos que actuam no passo de maturação do ciclo de replicação do HIV-1, tais como ribozimas que localizam ao HIV-1 virions 32 e moléculas baseadas em anti-sentido que inibem o processamento da mordaça, para além do VIH-1 a expressão da proteína 13, 31. Uma limitação de ensaios de produção virai é que as células utilizadas não expressam os receptores apropriados para o HIV-1 de entrada e não pode ser usado para avaliar os efeitos terapêuticos de ARN de HIV-1 de entrada ou de integração. Para avaliar os efeitos de anti HIV-1 ARN em todo o ciclo de replicação, vários modelos de infecção por HIV-1 têm sido utilizadas em diferentes linhas de células T de linfócitos ou células sanguíneas primárias 5,33. Uma vez que estas linhas celulares são difíceis de transfectar, mais métodos de trabalho intensivo, como a inserção de genes de vetor lentiviral ou aptâmero / conjugação de péptidos são necessários para entregar uma quantidade suficiente de HIV-1 anti RNAs para observar os efeitos na replicação do HIV-1. Esta limitação torna difficult comparar rapidamente a relação estrutura-actividade entre variantes de um determinado ARN anti-HIV-1 ou realizar o rastreio em larga escala para identificar o local alvo ideal para novas classes de anti-HIV-1 RNA. Embora os ensaios de produção virais têm sido úteis para identificar novas moléculas anti-HIV-1-RNA, modelos celulares alternativos em linhas celulares facilmente transfectadas que suportam a replicação de HIV-1, tais como células-bl TZM, seria útil para o rastreio de anti-HIV-1 RNAs dirigidas a outras etapas do ciclo de replicação, como a entrada e integração. Dependendo da classe de anti-HIV-1-RNA, foram descritos vários mecanismos potenciais de toxicidade. Por exemplo, ARN anti-sentido com base em pode ter efeitos fora do alvo de ARN celulares contendo a mesma ou uma sequência semelhante ao seu local alvo pretendido em HIV-1 RNA. Da mesma forma, aptâmeros de RNA, modelado após o elemento de resposta de trans-activação (TAR) ou Rev elemento de resposta (RRE), pode afetar a função do pr celularoteins, tais como a proteína de ligação de ARN de TAR (TRBP) 34. shRNAs siRNAs e têm o potencial para afectar adicionado a via interferência de ARN por sequestrantes proteínas de ARNi 35 e algumas moléculas U1i foram mostrados para afectar o splicing e de processamento de ARN celular por sequestro de proteínas da pequena U1 RNA-proteína nuclear complexo 36. Embora alguns desses efeitos podem ser minimizados pelo design cuidado, as medições da toxicidade celular em telas para novas moléculas anti-HIV-1 RNA são úteis na exclusão de moléculas com potenciais efeitos fora do alvo de maior desenvolvimento. Além disso, os efeitos fora do alvo poderia indiretamente inibir HIV-1 de produção, tornando toxicidade celular uma medida importante na validação da eficácia de novos anti HIV-1-moléculas identificados a partir de telas de HIV-1 de produção. O ensaio de viabilidade celular descrito nas etapas 3.1. para 3,4. é uma variante de um ensaio padrão que tem sido utilizado para rastrear molécula antiviral diversificada<html> S 37. O ensaio mede a actividade de enzimas celulares de NAD (P) H-dependentes para reduzir o reagente MTT a sua forma insolúvel púrpura, formazano. O protocolo é adaptado de métodos previamente publicados 38 e vários kits estão disponíveis usando MTT ou outros reagentes estreitamente relacionadas. Embora seja importante para ensaio de viabilidade celular na linha celular utilizada para o rastreio de anti-HIV-1 RNA, deve notar-se que diferentes linhas de células variar na sua sensibilidade para a toxicidade induzida por ARN. Por exemplo, Reynolds et ai. Demonstraram que os siRNAs Dicer substrato não teve nenhum efeito sobre a viabilidade celular em células HEK293T, mas a viabilidade celular significativamente reduzida em células MCF7, DU145 e células HeLa S3 39. Para o ensaio aqui descrito, as células HEK293T são usados ​​como um exemplo (Figura 4); No entanto, o mesmo ensaio foi também realizado em células MCF-7 para avaliar a toxicidade potencial de uma linha de células que é mais sensível a pequenas toxicidade induzida por 16 de ARN. e_content &quot;&gt; Uma vez que o HIV-1 anti ARN não pode ser processado e apresentado ao sistema imunitário adaptativo, eles são considerados menos imunogénica em comparação com anti-HIV-1 de proteínas ou péptidos. No entanto, dependendo da sua sequência ou estrutura, que pode eliciar inata respostas imunes, e vários sensores imunes e vias de sinalização tenham sido identificados que podem responder aos pequenos RNAs (revisto em 40). no ensaio de activação imunitária aqui descrita, os níveis de PKR fosforilada e IRF3 foram comparados em células transfectadas com pequenos RNAs como um indicação de PKR ou TLR3 activação, respectivamente. Ambos os sensores de ARN estão presentes numa vasta gama de linhas celulares e a sua activação pode levar à produção de tipo 1 interferões e, no caso de PKR, uma paragem de tradução. para avaliar o potencial para anticorpos anti HIV-1-RNA para activar a produção de interferons do tipo 1 por vias alternativas, os níveis da ADAR1 gene estimulado-interferão (p150) foram também comparados em células transfectadas comanti-HIV-1 RNA. Tal como demonstrado pelos efeitos do tempo de controlo positivo ARNcd, poli I: C, todas estas respostas eram activos em células HEK293T (Figura 5) e foram observados efeitos semelhantes em células MCF7 16. Uma vez que estas respostas poderiam inibir a produção do VIH-1, na ausência de efeitos sobre a viabilidade das células, o ensaio de activação imune fornece uma validação adicional para a eficácia de novos RNAs anti-HIV-1. Outras medidas que podem ser adicionados a esta avaliação incluem a medição da produção de citoquinas inflamatórias do tipo 1 e interferões no sobrenadante da cultura celular, e medindo a expressão de vários genes de interferão-estimuladas. Uma vez que as células alvo do HIV, tais como as células T CD4 + e os macrófagos podem expressar níveis diferentes de sensores imunes inatas, candidatos identificados a partir dos ensaios descritos no presente protocolo também devem ser avaliadas por estimulação imunológica potencial nestes tipos de células. Para todos os ensaios descrevemd, o passo crítico para a obtenção de resultados reprodutíveis e precisos, é a preparação dos tubos de transfecção de ADN ou ARN (passo 1.3.). O DNA de plasmídeo ou de ARN deve ser de elevada pureza com concentrações determinada com precisão. Também é crítico para incluir os controlos apropriados. Para a avaliação de novos plasmídeos de expressão de ARN de teste no ensaio de produção viral, um controlo negativo adequado é o plasmídeo de expressão vazio. Para os ARN anti-sentido com base em, um plasmídeo de controlo negativo adicional que expressa um ARN não segmentação também devem ser incluídos. As sequências para uma ribozima não-direccionamento e shRNA que não afectam a produção de HIV são fornecidos em 13. Para siRNAs de teste, o único controlo negativo que pode ser utilizado é um ARN não-direccionamento e um não-sequência de direccionamento siRNA apropriado para o ensaio de produção virai é fornecida em 16. Para a viabilidade celular e ensaios de activação do sistema imunológico, o controlo negativo deve ser células tratadas com o reagente de transfecção sozinho e é critical que um controlo positivo, tal como poli I: C é incluído para confirmar que as células são sensíveis à toxicidade induzida por ARN ou activação imunitária. Para os plasmídeos de expressão de ARN, o plasmídeo vazio também devem ser incluídos para garantir que o próprio vector não tem efeitos tóxicos sobre as células. Em geral, os ensaios aqui descritos representam um bom primeiro passo para a identificação de terapias de ARN seguros e eficazes para utilização no HIV-1 gene ou a terapia de droga. As moléculas de direccionamento para o HIV-1 RNA, é também importante considerar a conservação do seu local alvo em métodos detalhados estirpes de HIV-1 circulante, e para calcular a conservação da sequência foram publicados previamente 15. Para mover uma molécula para a frente em ensaios clínicos, estudos de toxicidade e eficácia a longo prazo devem ser realizados em células humanas primárias e em modelos animais para confirmar que os candidatos identificados serão segura e eficaz na clínica.

Uma limitação dos actuais tratamentos do HIV-1 é que eles devem ser cronicamente administrado para prevenir a progressão da doença. Transplantação de VIH-1 resistente a linfócitos T, ou células-tronco hematopoiéticas, tem o potencial para proporcionar um controlo de longa duração de replicação do HIV-1 na ausência do tratamento medicamentoso 1,2 e pode também ser uma abordagem eficaz para atingir uma cura de HIV-1 3. Uma maneira de tornar as células resistentes ao HIV-1 é a replicação para inserir um ou mais genes que codificam para anti-HIV-1 RNA ou péptidos em células de um indivíduo infectado durante um transplante autólogo 4. Vários genes candidatos anti-VIH-1 foram concebidos com alguns estudos clínicos que entram em combinações de dois ou três 5 6, para prevenir o desenvolvimento de resistência do HIV-1 para um único gene. Anti-HIV-1 RNA estão entre os principais candidatos para a terapia de combinação de genes devido ao seu baixo potencial para provocar respostas imunes e porquesão transcritas a partir de sequências de genes muito curtos. Alguns-HIV-1 anti RNAs foram projetados para direcionar entrada e de integração viral. No entanto, a maioria dos ARNs anti-HIV-1 como alvo passos pós-integração no ciclo de vida viral (Figura 1). Inibidores pós-integração incluem RNAs de engodo, tendo como alvo os HIV-1 proteínas reguladoras Tat ou Rev 1, e RNAs à base de anti-senso, tendo como alvo locais diferentes em HIV-1 RNA, como as ribozimas 7, 8 e shRNAs U1i RNAs 9. Os métodos que foram utilizados para comparar a eficácia dos anti-HIV-1-RNA incluem a monitorização de replicação virai nas células transduzidas com genes que codificam para os ARN candidatas e medindo a produção virai em células transitoriamente transfectadas com plasmídeos que expressam os ARN candidatas e um plasmídeo de expressão de HIV-1 10 -13. Nós já usou um ensaio de produção HIV-1 para a tela HIV-1 RNA para sites de destino nova ribozimas 13-15. Estes métodos já foram refinados para optimizar o formato de um ARNmolécula de interferência expressa a partir de DNA de plasmídeo como um shRNA ou entregue como um siARN sintética 16. O ensaio mede a produção de vírus maduras a partir de células 293T de rim embrionário humano (HEK), e pode ser usado para comparar os efeitos dos inibidores que têm como alvo as etapas de pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1 (Figura 1). Para os inibidores que têm como alvo as etapas de pré-integração, ensaios alternativos, tais como um ensaio de infecciosidade de células TZM BL-17 são necessários para avaliar a eficácia antiviral. As principais preocupações de segurança para a entrega de anti-HIV-1 RNA na clínica incluem potenciais efeitos fora do alvo em RNAs humanos ou proteínas, e ativação de sensores imune inata. Para avaliar a toxicidade do anti-HIV-1 siRNAs, utilizou-se um ensaio de viabilidade celular em diferentes linhas celulares 16. Nós também medido activação dos sensores imunes ARN de cadeia dupla, ARN activada proteína quinase R (PKR) e Toll like receptor 3 (TLR3), bem como expressão do gene de interferão estimulada, p150 ADAR1. Estes ensaios podem ser utilizados para confirmar que a eficácia do anti-HIV-1 RNA não é devido aos efeitos indirectos sobre a viabilidade celular ou a activação do sensor imune. Eles são também úteis na exclusão com RNAs candidatos potenciais toxicidades de desenvolvimento posterior. Nos seguintes protocolos, os procedimentos para identificar novos RNAs terapêuticos e optimizar o formato das existentes são descritos. Os métodos são úteis para inibidores pós-integração baseadas em ARN rastreio de HIV-1 da replicação e pode ser adaptado para o rastreio de outros inibidores pós-integração, tais como pequenas moléculas de direccionamento Rev exportação mediada por ARN viral 18 ou CRISPR / sistemas Cas concebidos para direccionar integrada HIV-1 DNA 19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353075, 353047, 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes Axygen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>311-08-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular weight Poly I:C</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>3182-29-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DharmaFECT-1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>T-2001-01</td>
			<td>transfection reagent for synthetic RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td>transfection reagent for RNA expression plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 (NP-40)</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[32P]dTTP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>BLU505H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(A) RNA template&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10108626001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo(dT)12-18 DNA primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18418-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEAE filtermat paper&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1706930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001, 4906837001</td>
			<td>protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel running chamber</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-dry transfer cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder EZ-Run</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP3603-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>162-0094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody stripping solution</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL - Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>PI32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADAR1 antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. B.L. Bass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-T446-PKR antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-S396-IRF3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. A. Hovanessian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRF3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>11904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-labeled goat anti-rabbit</td>
			<td>KPL</td>
			<td>474-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-labeled goat anti-mouse</td>
			<td>KPL</td>
			<td>474-1806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6226-79-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the efficacy and toxicity of rnas targeting hiv-1 production for use in gene or drug therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Um esquema geral dos processos é mostrado na Figura 2, com um plano de transfecção exemplo para três RNAs de teste e um ARN de controlo fornecida na Figura 2B. Para os ensaios de viabilidade celular de produção e virais, a leitura para cada construto de teste é normalizada para um controlo negativo. Os duplicados estão transfectadas em conjuntos, de modo que cada ARN teste é normalizado para o seu controlo negativo adjacente. Isto é feito para evitar dados incorrectos relacionados com o tempo entre a complexação e a transfecção, o que pode ocorrer se, por exemplo, todos os controlos negativos são transfectadas primeiro. Uma vez que o HIV-1 pode afectar as respostas imunitárias 27,28, a viabilidade celular e ensaios de activação do sistema imunológico são feitas sem a adição de um VIH-1 expressando plasmídeo. Para identificar a duração óptima de moléculas de interferência de ARN alvo um local conservado em HIV-1 RNA (posição 1498-141519 em estirpe HIV-1 NL4-3) 13, um conjunto de siRNAs foram desenhados (Figura 3A). Utilizando o ensaio de produção de HIV-1, a percentagem de actividade de RT comparado com células transfectadas com um longo Dicer substrato absurdo siRNA (Sins) foi calculada para as células transfectadas com cada um siRNA de teste em diferentes quantidades de co-transfecção com 100 ng de um plasmídeo que expressa estirpe HIV-1 NL4-3 (Figura 3B). Usando o ensaio de viabilidade celular, o metabolismo por cento de MTT foi determinada para as células transfectadas com os siRNAs mais eficazes identificadas na Figura 3B. Os dados foram normalizados para o metabolismo de MTT em células tratadas com o reagente de transfecção sozinho (Figura 4). Uma longa ARN de cadeia dupla (Poly I: C) reduziu a viabilidade celular; No entanto, o efeito foi significativo apenas na dose mais elevada avaliada. Não foi observada redução significativa na viabilidade celular para siRNAs visando a si 1498<html> te em ARN VIH-1, independentemente do seu comprimento. Usando o ensaio de activação imunitária, o mesmo conjunto de RNAs foram avaliadas quanto ao seu potencial para desencadear respostas imunes (Figura 5). Em condições em que a poli I: C activada a expressão de p150 ADAR1 e fosforilação induzida de PKR e IRF3, sem efeito significativo nos marcadores de activação imunitária poderia ser observado para qualquer um dos RNAs de teste. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54486/54486fig1.jpg" /> Figura 1. Representação esquemática das etapas de pré e pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1. Pré-integração (1-3) e de pós-integração (4-7) passos no ciclo de replicação do HIV-1 são apresentados em caixas delineadas . <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54486/54486fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54486 / 54486fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Representação esquemática da produção viral, a viabilidade celular e ensaios de ativação imune. Células aderentes (A) placa e cultura, durante 24 horas. As células são plaqueadas em 24-, 96- e 12- placas de poços em 500, 100 e 1.000 ul de meio de cultura celular para a produção virai, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente. (B) Prepare tubos de transfecção, as células transfectar e cultura durante 48 horas. Um exemplo de plano de transfecção de um conjunto de três RNAs de ensaio (RNA1-3) é mostrado com os controlos apropriados. O procedimento de transfecção é também ilustrada. (C) Leia-out. A leitura de para a produção viral, a viabilidade celular e ensaios de ativação imune são escritos e explicados em detalhe nas secções 2, 3 e 4, respectivamente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54486/54486fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54486/54486fig3.jpg" /> Figura 3. Efeito de siRNAs de teste para o HIV-1 de produção. (A) Projeto de siRNAs com diferentes comprimentos e simetrias. Uma sequência conservada no RNA do HIV-1 (1,498 local alvo) foi utilizada para desenhar os siRNAs simétricos e assimétricos (si1498-) com diferentes comprimentos (17 e 29 cadeias de sentido de nucleótidos). O sentido esperado (parte superior, preto) e antisense (parte inferior, vermelho) vertentes são indicadas. (B) Inibição da produção de HIV-1 por variantes de comprimento si1498. A percentagem de inibição (%) do HIV-1 a actividade de RT no sobrenadante das células HEK293T transfectadas com variantes comprimento si1498 simétricas ou assimétricas é mostrado em relação a uma longa absurdo substrato Dicer siRNA (pecados). Cada ARN de teste foi comparado com pecados de diferentes doses em pelo menos duas transfecções independentes com dois a três repetições. Os dados são exprEssed como valores médios ± meios de erro padrão (SEMs). Esta figura foi modificada a partir de 16, copyright Sociedade Americana de Microbiologia. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54486/54486fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54486/54486fig4.jpg" /> Figura 4. Efeito do comprimento si1498 variantes sobre a viabilidade celular de células HEK293T foram transfectadas com poli I:. C, a 50 e 200 ug / ml (pIC50 e PIC200) e comprimentos diferentes e formatos de si1498 a 100 nM. O metabolismo% de MTT foi determinada relativamente a células tratadas com o reagente de transfecção sozinho (Mock, M) em três transfecções independentes com dois a três repetições. Os dados são expressos como valores médios ± SEMs. Student não pareado testes t foram usadas para determinar se a diferentes transfecções significantly (*, P &lt;0,05) reduziu a viabilidade celular relativa para as células falsamente transfectadas. Esta figura foi modificada a partir de 16, copyright Sociedade Americana de Microbiologia. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54486/54486fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54486/54486fig5.jpg" /> Figura 5. Efeito do comprimento si1498 variantes em respostas imunes inatas. Células HEK293T foram transfectadas com pIC50, PIC200 e comprimentos diferentes e formatos de si1498 a 100 nM. A activação de PKR e TLR3 foram avaliados através da medição da PKR fosforilada e IRF3, respectivamente. A expressão de um gene de interferão estimulada (ISG) foi avaliada através da medição dos ISG ADAR1 P150 níveis relativos à variante constitutivamente expresso, p110 ADAR1. A expressão da actina foi utilizado como um controlo de carga. esta figure foi modificado a partir de 16, copyright Sociedade Americana de Microbiologia. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54486/54486fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome do Tampão / Reagente </td><td> Composição </td></tr><tr><td> Cocktail interrupção Viral </td><td> Tris-HCl 60 (a partir de Tris-HCl 1 M, pH 7,8), KCl 75 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1,04 mM, 1% de NP-40. </td></tr><tr><td> cocktail radioativo </td><td> Tris-HCl 60 (a partir de Tris-HCl 1 M, pH 7,8), KCl 75 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1,04 mM, 10 ug / ml de poli (A), 0,33 ug / ml de oligo dT. Adicionado imediatamente antes da utilização: ditiotreitol 8 mM (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) e 5 ul [32 P] dTTP (3.000 Ci / mmol) Por cada 500 ul de coquetel. </td></tr><tr><td> Radioactive cocktail perturbação / viral </td><td> Tris-HCl 60 (a partir de Tris-HCl 1 M, pH 7,8), KCl 75 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1,04 mM, 0,1% de NP-40, 5 ug / ml de poli (A), 0,16 ug / oligo ml dT. Adicionado imediatamente antes da utilização: ditiotreitol 8 mM (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) e 5 uL de [32P] dTTP (3000 Ci / mmol) para cada 1 mL de coquetel. </td></tr><tr><td> 2x SSC </td><td> 17,53 g de NaCl e 8,82 g de citrato de sódio - 2H 2 O em 2 O. 1 LH </td></tr><tr><td> O tampão de lise </td><td> Tris-HCl 50 (a partir de Tris-HCl 1 M, pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM (a partir de 0,5 M, pH 8,0), 10% v / v de glicerol, 1% v / v de NP-40. </td></tr><tr><td> Ponceau S </td><td> 2,5 g de Ponceau S e 5 ml de ácido acético em 500 ml de H 2 O. </td></tr><tr><td> TBST </td&gt; <td> 6,05 g de Tris, 8,76 g de NaCl e 1 mL de Tween 20 em 1 LH 2 O. </td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Componentes de tampões não-comerciais e reagentes Receitas para todos os tampões não comerciais e reagentes são fornecidos.

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Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

evaluation-efficacy-toxicity-rnas-targeting-hiv-1-production-for-use

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K visualizações.  Lady Davis Institute for Medical Research. Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones. 

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Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Imunologia e Infecção

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento de exossomas a partir do plasma de indivíduos HIV-1 positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Medição de<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...