O objetivo desses procedimentos é avaliar a integridade das membranas espermatozoides utilizando sondas fluorescentes específicas combinadas com microscopia de fluorescência ou análise de citometria de fluxo. Essas técnicas podem ajudar a responder a perguntas-chave no campo da reprodução, como a previsão do potencial de fertilização e a qualidade da amostra de espermatozoides. A principal vantagem dessas técnicas é que elas permitem uma avaliação precisa de múltiplas membranas espermatozoides que são conhecidas por associar-se ao potencial de fertilização do esperma.
As implicações dessas técnicas se estendem para o diagnóstico da qualidade da ejaculação, pois permite uma avaliação mais precisa do plasma de espermatozoides e da integridade da membrana acrosana, bem como do potencial da membrana mitocondrial. Para iniciar este procedimento, obtenha aproximadamente um a seis mililitros de sêmen de touro em um tubo de 15 mililitros à temperatura ambiente. Adicione seis mililitros de tampão NKM pré-aquecido a 37 graus Celsius a cada um mililitro de sêmen.
Centrifugar a 600 vezes g por oito minutos. Repita a centrifugação uma ou duas vezes até que o sobrenatante esteja limpo. Depois disso, descarte imediatamente a maior parte do supernante, deixando aproximadamente um centímetro de sobrenante acima da pelota.
Incline cuidadosamente os tubos em um ângulo de 30 graus na incubadora e espere de 20 a 30 minutos para permitir que os espermatozoides nadem para cima. Usando uma micropipette, remova cuidadosamente o mililitro restante de supernadário que agora contém o espermatozoide motile e transfira-o para um tubo fresco de 1,5 mililitro. Mantenha o esperma a 37 graus Celsius até estar pronto para usar.
Primeiro, prepare todas as soluções de estoque necessárias, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira 133 microliters do espermatozoide motile a uma concentração de 25 milhões de espermatozoides por mililitro para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione 17 microliters da solução de trabalho DAPI e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Centrifugar a 1.000 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e adicione 100 microliters de tampão NKM à pelota. Em seguida, adicione 50 microliters de FITC-PSA, dois microliters de JC-1, e três microliters de PI. Incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Centrifugar a 1.000 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 40 microliters de tampão NKM. Em seguida, transfira 10 microliters da amostra para um slide de vidro.
Esfregue a amostra e adicione uma mancha de cobertura. Depois disso, imediatamente comece a visualizar a amostra por microscopia de epifluorescência com um objetivo de 40X e um filtro triplo conforme descrito no protocolo de texto, usando uma câmera digital para capturar uma imagem separada para cada filtro. Use a opção mesclar no software da câmera para mesclar as três imagens recebidas dos filtros, salvando o novo arquivo no formato JPEG.
Abra a imagem mesclada com a ferramenta de pintura e use a opção pincel para marcar o espermatozoide contado. Em seguida, classifique o espermatozoário com base na fluorescência emitida de cada sonda, certificando-se de avaliar pelo menos 200 espermatozoides por slide. Todas as células devem parecer azuis do DAPI.
Conte as células mortas, que parecem roxas, para avaliar a viabilidade. Em seguida, use os padrões de coloração de fluorescência para avaliar o estado acrosto. Por fim, avalie o potencial da membrana mitocondrial distinguindo os espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial que exibem uma peça média manchada de vermelho do espermatozoário com baixo potencial de membrana mitocondrial que exibem uma peça média manchada de verde.
Conte as peças vermelhas e verdes separadamente e calcule sua razão. Para iniciar a avaliação da integridade da membrana plasmática, pegue o número desejado de poços a partir do kit de viabilidade e concentração. Transfira os poços para a base de trabalho e cubra-os com uma tampa flexível para protegê-los da luz.
Adicione 199 microliters de solução tamponada para citometria a cada poço. Em seguida, adicione um microliter de sêmen homogêneo a uma concentração de 57 milhões de células por mililitro a cada poço e homogeneize por pipetação. Cubra a placa com a tampa e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Depois disso, execute a amostra através do citômetro de fluxo usando o ajuste de viabilidade. Para começar a avaliar o potencial da membrana mitocondrial, retire o número desejado de poços do kit de atividade mitocondrial. Transfira-os para a base de trabalho.
Adicione 10 microliters de etanol absoluto a cada poço e use uma pipeta para resuspensar o pó presente dentro do poço. Adicione 190 microliters de PBS por poço e homogeneize por pipetação. Adicione 0,75 microliters de sêmen homogêneo a uma concentração de 57 milhões de células por mililitro a cada poço e homogeneize por pipetação.
Cubra a placa com a tampa e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, execute a amostra através do citómetro de fluxo usando a configuração de atividade mitocondrial. Para começar a avaliar a integridade da membrana acrosomal, retire o número desejado de poços a partir do kit de viabilidade e integridade acrosma.
Transfira os poços para a base de trabalho e cubra-os com uma tampa flexível para protegê-los da luz. Adicione 200 microliters de solução tamponada para citometria a cada poço. Em seguida, adicione 0,7 microliters de sêmen homogêneo a uma concentração de 57 milhões de células por mililitro a cada poço e homogeneize por pipetação.
Cubra a placa com a tampa e incubar a 37 graus Celsius por 45 minutos. Depois disso, execute a amostra através do citômetro de fluxo usando a configuração de insight. Neste estudo, a qualidade do sêmen é avaliada utilizando-se diferentes técnicas, uma das quais avaliou as membranas espermatozoides utilizando sondas fluorométricas.
É possível avaliar as diferenças na qualidade da amostra de esperma em termos de integridade da membrana. Por exemplo, a ejaculação do touro número sete tinha uma porcentagem relativamente baixa de células mortas, uma baixa proporção de espermatozoides com acrossomo pseudo-reagido, e maior potencial de membrana mitocondrial quando comparado com a ejaculação do touro número um. As amostras são então avaliadas para viabilidade e atividade mitocondrial.
Os histogramas para esses exemplos representativos representam os espermatozoides untados e os detritos e os espermatozoides fechados. Esses histogramas também representam as células viáveis e mortas e a distribuição de espermatozoides à membrana mitocondrial polarizada e des polarizada. A integridade acrosma é então avaliada com um kit pronto para uso e lida com citometria de fluxo, dividindo a área em três áreas de marcador que representam células de baixa fluorescing insignificantes com acrosmos intactas não manchadas, células fluorescentes baixas com parte manchada residual do acrosomo, e células altamente fluorescentes com acrooso interrompido.
Ao tentar esses procedimentos, é importante ter certeza de preparar adequadamente a amostra inicial de espermatozoides. Essas técnicas podem fornecer insights sobre a avaliação da qualidade do esperma e podem ser aplicadas a vários organismos, como bovinos, aves e humanos. A comparação entre as duas técnicas, a coloração quádrupla e a citometria de fluxo não indicaram diferenças significativas para a viabilidade, o potencial da membrana mitocondrial e a integridade acrosma revelando que as duas técnicas produziram resultados correspondentes.
