L'obiettivo di queste procedure è valutare l'integrità delle membrane spermatica utilizzando specifiche sonde fluorescenti combinate con microscopia a fluorescenza o analisi della citometria del flusso. Queste tecniche potrebbero aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riproduzione come la previsione del potenziale di fecondazione e la qualità del campione di spermatozoi. Il vantaggio principale di queste tecniche è che consentono una valutazione precisa di più membrane spermatica che sono note per associarsi al potenziale di fecondazione dello sperma.
Le implicazioni di queste tecniche si estendono verso la diagnosi della qualità dell'eiaculato in quanto consente una valutazione più accurata del plasma spermatico e dell'integrità della membrana acrosoma, nonché del potenziale della membrana mitocondriale. Per iniziare questa procedura, ottenere circa uno o sei millilitri di sperma di toro in un tubo da 15 millilitri a temperatura ambiente. Aggiungere sei millilitri di tampone NKM pre-riscaldato a 37 gradi Celsius a ciascuno millilitro di sperma.
Centrifuga a 600 volte g per otto minuti. Ripetere la centrifugazione una o due volte fino a quando il supernatante non è chiaro. Successivamente, scartare immediatamente la maggior parte del supernatante, lasciando circa un centimetro di supernatante sopra il pellet.
Appoggiare con cura i tubi con un angolo di 30 gradi nell'incubatore e attendere da 20 a 30 minuti per consentire agli spermatozoi di nuotare. Utilizzando una micropipetta, rimuovere con cura il rimanente millilitro di supernatante che ora contiene gli spermatozoi mobile e trasferirlo in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Mantenere lo sperma a 37 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso.
In primo luogo, preparare tutte le soluzioni stock necessarie come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire 133 microlitri degli spermatozoi motili a una concentrazione di 25 milioni di spermatozoi per millilitro in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 17 microlitri della soluzione di lavoro DAPI e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Centrifuga a 1.000 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere 100 microlitri di tampone NKM al pellet. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di FITC-PSA, due microlitri di JC-1 e tre microlitri di PI. Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Centrifuga a 1.000 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 40 microlitri di tampone NKM. Quindi trasferire 10 microlitri del campione in uno scivolo di vetro.
Spalmare il campione e aggiungere un coverslip. Successivamente, inizia immediatamente a visualizzare il campione con la microscopia a epifluorescenza con un obiettivo 40X e un filtro triplo come delineato nel protocollo di testo, utilizzando una fotocamera digitale per catturare un'immagine separata per ogni filtro. Utilizzare l'opzione di unione nel software della fotocamera per unire le tre immagini ricevute dai filtri, salvando il nuovo file in formato JPEG.
Aprite l'immagine unita con lo strumento pittura e usate l'opzione pennello per contrassegnare gli spermatozoi contati. Successivamente, classificare gli spermatozoi in base alla fluorescenza emessa da ciascuna sonda, assicurandosi di valutare almeno 200 spermatozoi per diapositiva. Tutte le celle devono apparire blu dal DAPI.
Conta le cellule morte, che appaiono viola, per valutare la vitalità. Quindi utilizzare i modelli di colorazione a fluorescenza per valutare lo stato acrosoma. Infine, valutare il potenziale della membrana mitocondriale distinguendo gli spermatozoi ad alto potenziale di membrana mitocondriale che presentano un centrotavola macchiato di rosso dagli spermatozoi a basso potenziale di membrana mitocondriale che presentano un centrotavola macchiato di verde.
Contare separatamente i centrotavola rossi e verdi e calcolarne il rapporto. Per iniziare la valutazione dell'integrità della membrana plasmatica, prendere il numero desiderato di pozzi dal kit di vitalità e concentrazione. Trasferire i pozzali alla base di lavoro e coprirli con un coperchio flessibile per proteggerli dalla luce.
Aggiungere 199 microlitri di soluzione tamponata per la citometria ad ogni pozzo. Quindi aggiungere un microlitro di sperma omogeneo ad una concentrazione di 57 milioni di cellule per millilitro ad ogni pozzo e omogeneizzare mediante pipettazione. Coprire la piastra con il coperchio e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Successivamente, eseguire il campione attraverso il citometro di flusso utilizzando l'impostazione di vitalità. Per iniziare a valutare il potenziale della membrana mitocondriale, eserti il numero desiderato di pozzi dal kit di attività mitocondriale. Trasferirli alla base di lavoro.
Aggiungere 10 microlitri di etanolo assoluto ad ogni pozzo e utilizzare una pipetta per rimostrare la polvere presente all'interno del pozzo. Aggiungere 190 microlitri di PBS per pozzo e omogeneizzare mediante pipettazione. Aggiungere 0,75 microlitri di sperma omogeneo ad una concentrazione di 57 milioni di cellule per millilitro ad ogni pozzo e omogeneizzare mediante pipettazione.
Coprire la piastra con il coperchio e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, eseguire il campione attraverso il citometro di flusso utilizzando l'impostazione dell'attività mitocondriale. Per iniziare a valutare l'integrità della membrana acrosomica, esegna il numero desiderato di pozzi dal kit di integrità acrosoma e vitalità acrosoma.
Trasferire i pozzali alla base di lavoro e coprirli con un coperchio flessibile per proteggerli dalla luce. Aggiungere 200 microlitri di soluzione tamponata per la citometria ad ogni pozzo. Aggiungere quindi 0,7 microlitri di sperma omogeneo ad una concentrazione di 57 milioni di cellule per millilitro ad ogni pozzo e omogeneizzare mediante pipettazione.
Coprire la piastra con il coperchio e incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Successivamente, eseguire il campione attraverso il citometro di flusso utilizzando l'impostazione insight. In questo studio, la qualità dello sperma viene valutata utilizzando diverse tecniche, una delle quali ha valutato le membrane spermatica utilizzando sonde fluorometriche.
È possibile valutare le differenze nella qualità del campione di sperma in termini di integrità della membrana. Ad esempio, l'eiaculato del toro numero sette aveva una percentuale relativamente bassa di cellule morte, una bassa percentuale di spermatozoi con acrosoma pseudo-reagito e un maggiore potenziale di membrana mitocondriale rispetto all'eiaculato del toro numero uno. I campioni vengono quindi valutati per la vitalità e l'attività mitocondriale.
Gli istogrammi per questi esempi rappresentativi rappresentano gli spermatozoi e i detriti non datati e gli spermatozoi recintati. Questi istogrammi rappresentano anche le cellule vitali e morte e la distribuzione degli spermatozoi alla membrana mitocondriale polarizzata e depolarizzata. L'integrità acrosoma viene quindi valutata con un kit pronto all'uso e letta con citometria a flusso, dividendo l'area in tre aree marcatori che rappresentano cellule trascurabili a bassa fluorescenza con acrosoma intatto non macchiato, celle a bassa fluorescenza con parte macchiata residua dell'acrosoma e cellule altamente fluorescenti con acrosoma interrotto.
Durante il tentativo di queste procedure, è importante assicurarsi di preparare correttamente il campione iniziale di spermatozoi. Queste tecniche possono fornire informazioni sulla valutazione della qualità dello sperma e possono essere applicate a vari organismi come bovini, pollame e umani. Il confronto tra le due tecniche, la colorazione quadrupla e la citometria del flusso non ha indicato differenze significative per la vitalità, il potenziale della membrana mitocondriale e l'integrità acrosoma rivelando che le due tecniche hanno prodotto risultati corrispondenti.
