Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre dormência na planta amadeirada, como por que os botões de flores precisam acumular frio durante o inverno para florescer corretamente. A principal vantagem desta técnica é que permite a quantificação do amido em amostras muito pequenas de primordium de flor. Esta abordagem é muito útil para detectar a atividade fisiológica do primordium da flor durante a dormência e também pode ser aplicada a outras espécies de árvores como damasco ou ameixa.
Embora este método possa fornecer uma visão do broto de flores adormecido, ele também pode ser aplicado a outros processos, como a fase reprodutiva da polinização ao início da frutífera. Para começar, colecione cinco tiros do campo. Em seguida, pese e fixe 10 botões de flor em um tubo de vidro de 10 mililitros com solução fixativa por pelo menos 24 horas a quatro graus Celsius.
Depois disso, descarte o fixador e adicione 75% de etanol suficiente para cobrir as amostras. Obtenha três brotos de 15 a 30 centímetros de comprimento e cinco milímetros de diâmetro com 10 botões de flores cada. Em seguida, coloque os brotos na espuma de florista encharcada de água em uma câmara de crescimento.
Depois de 10 dias na câmara de crescimento, remova os botões de flores dos brotos e pese-os. Toda semana, desde o início do outono até a explosão na primavera, avalie o crescimento dos botões de flores. Remova as escamas externas de cada amostra e coloque cada broto no copo de um relojoeiro contendo 75% de etanol.
Use fórceps de precisão e um bisturi oftalmológico para dissecar os botões e obter pelo menos uma flor primordium de cada broto. Incorpore as amostras individualmente em cera de parafina para formar um bloco e seccioná-las em um microtome rotativo. Depois de seccionar as amostras, aplique uma gota de iodo fresco de Lugol sobre uma seção.
Após cinco minutos, remova o excesso de mancha com papel manchado. Em seguida, aplique uma pequena gota de mídia de montagem sintética, coloque um pequeno vidro de cobertura sobre a amostra e pressione com força. Uma vez que a mídia de montagem esteja seca, observe a seção manchada sob um microscópio de campo brilhante.
Primeiro ajuste o diafragma de abertura e o controle de brilho de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, certifique-se de que não há filtros no suporte do filtro e selecione uma condição de campo brilhante no microscópio. Depois disso, ajuste as configurações da câmera para a preparação manchada sem tecido.
Corrija o brilho em 50% Em seguida, ative a função de superexposição/subexposição e ajuste o tempo de exposição no limite da superexposição. Aplique a função de equilíbrio de branco e a correção do sombreamento. Meça o nível cinzento da imagem em preto e branco resultante da preparação manchada sem tecido.
Em seguida, aplique um filtro 4N, adquira outra imagem em preto e branco da preparação e meça o nível cinza. Em seguida, adquirir uma imagem da mesma preparação sem luz e medir o nível cinza da imagem resultante e calibrar. Depois disso, adquira uma imagem colorida de uma seção de amostra no formato TIFF com uma resolução de pelo menos 300 dpi.
Crie uma imagem binária correspondente à área manchada e, em seguida, defina os três limiares de cor até que a imagem binária reflita exatamente os grânulos de amido manchados. Repita este processo com outras preparações e tecidos para ajustar os níveis finais de detecção. Usando o sistema de análise de imagens, meça a soma da densidade óptica de cada pixel sob a máscara para quantificar o conteúdo do amido no campo.
Neste protocolo, o crescimento do broto de flor e o estado de dormência foram avaliados medindo o aumento do peso do broto após 10 dias em condições adequadas. Durante a dormência, não foram observadas alterações após 10 dias em condições adequadas. Uma vez que a dormência foi superada, os botões incharam e estouraram na câmara de crescimento.
O teor de amido no ovário primordium foi quantificado através da análise de imagem em cada seção microtómida. Consistentemente, a quantidade de amido no início do inverno apresentou um valor de densidade óptica inferior a 40.000 e a quantidade máxima atingiu um valor entre 120.000 e 140.000 durante ambos os anos do estudo. Levando-se em conta a dormência, a quantidade máxima de amido ocorreu concomitantemente com o cumprimento arrepiante durante ambos os anos.
É importante lembrar que os níveis de detecção utilizados pelo analisador de imagens dependem diretamente da calibração do sistema. Isso inclui condição de luz, intensidade da mancha e ampliação do microscópio. Esta condição deve ser fixada para todos os preparativos.
A combinação de técnicas histoquímicas com análise de imagem resultou muito útil para examinar a reserva de carboidratos da flor primordium durante as diferentes fases da dormência. Também pode ser aplicado a outras espécies e tecidos. A relação entre a liberação da dormência e o acúmulo de amido no ovário primordia revelado pelo uso deste método fornecem uma base sólida para entender a base biológica de dormência e requisitos de arrepiar.
O esforço futuro deve ser focado no estudo de indicadores biológicos confiáveis que poderiam facilmente indicar o estado de dormência da árvore. Enquanto isso, o padrão de variações de amido ao longo da dormência pode ser usado para enquadrar outros estudos fisiológicos e genéticos.
