A ciência da morfologia e a qualidade das células, grânulos de amido e os corpos proteicos no kernel determinam o peso e a qualidade das sementes. Neste estudo, apresentamos como uma população simples de um núcleo inteiro embutido na resina branca LR e estabelecemos um método simples de sucção a seco de grãos inteiros. Escolhemos a resina LR White como meio incorporado por duas razões principais.
Em primeiro lugar, é baixa viscosidade e forte permeabilidade, levando a suas boas aplicações no preparo desta poderosa seção de sementes, especialmente para grãos maduros de cereais com grande volume e alto teor de amido. Em segundo lugar, a amostra embutida na resina branca LR pode ser manchada facilmente com muitos corantes químicos para exibir claramente a morfologia de amostras sob luz com microscópio fluorescente. As seções preparadas podem ser especificamente manchadas para exibir as células, grânulos de amido e corpos proteicos claramente no surgimento de todo o kernel, e os parâmetros de morfologia também podem ser analisados quantitativamente.
O método contém estudos. Aqui, usamos grãos de milho maduros com maior volume e conteúdo de amido alto como amostra para exibir os processos passo a passo. Para começar, clipes kernels em uma garrafa simples.
Adicione cerca de 10 milímetros de glutaraldeído tamponado de fosfato de 2,5%. mais um pH 7.2 e colocá-lo em 4 graus centígrados por 48 horas para corrigir ambos. Em seguida, tire esses grãos e corte-os longitudinalmente ou transversalmente, com espessura de dois a três milímetros.
Você precisa de uma lâmina afiada de dois lados. E consertá-los por mais 48 horas. Em seguida, lave suas amostras três vezes com cerca de 10 milímetros, então 0,1 M tampão fosfato, pH 7,2 por 30 minutos todas as vezes.
Para hidratar as amostras passo a passo, mergulhe-as em cerca de 10 milímetros de solução aquosa de 30% de etanol por 30 minutos primeiro, e torça-as sucessivamente em 10 milímetros, então 50%70%90% uma vez, e 100% três vezes. Para se infiltrar em uma amostra passo a passo, recupere-os sucessivamente com 10 milímetros de solução de resina LR White diluída com etanol de 25%50%75% uma vez, e 100% duas vezes a quatro graus centígrados por 12 horas todas as vezes. Antes de incorporar, precisamos preparar os pedestais para amostras.
Adicione 250 microliters de resina branca LR pura em dois milímetros de tubo de centrífuga e polimerize-o a seis graus centígrados por 48 horas. Em seguida, adicione sucessivamente 500 microliters de resina branca LR pura e infiltre a amostra no tubo centrífuga com um pedestal. Depois de endireitar as amostras com agulha anatômica, coloque a resina a seis graus centígrados em um forno por 48 horas.
Retire os grãos incorporados do tubo centrífuga e corte o excesso de resina em torno de uma amostra usando uma lâmina afiada. Coloque o bloco de resina no suporte de amostra de microtona e corte a resina supérflua na superfície da amostra e ao redor da amostra com a lâmina. Polir ainda mais a superfície da amostra finalmente com uma faca de vidro até que uma seção completa possa ser formada.
Agora é hora de preparar esta seção incrível com dois mícrons de espessura. Antes de cortar, coloque um pequeno cobre falando cerca de dois milímetros acima da borda da lâmina para evitar que uma seção se enrole. À medida que a seção se alonga, coloque um falou sob a seção para apoiá-lo.
Em seguida, adicione os 100 microliters de água no escorregador não provagido e transfira cuidadosamente a seção completa e ininterrupta para a água com os tratadores. Aqueça e seque-os a 50 graus centígrados para suavizar a seção enrugada. Por fim, duas dicas importantes precisam de atenção.
Primeiro, se a seção desmoronar ou chorar, estenda o tempo para cada infiltração de resina da amostra. Em segundo lugar, se a seção tiver algumas linhas paralelas à faca, aperte firmemente o bloco de amostra. Se a seção tiver algumas linhas verticais para a faca, por favor, use uma faca nova.
Para observar a morfologia das células, grânulos de amido e corpos proteicos, podemos manchar as seções com brilho fluorescente 28, solução de iodo e R250 azul brilhante Coomassie, respectivamente. Para outras manchas específicas, basee-se na pesquisa da proposta. Aqui usamos a solução de iodo para manchar grânulos de amido como exemplo.
Adicione 40 microliters de solução de iodo para imergir a seção. E mantenha-o no pote por um minuto. E então cubra a amostra com uma manga de capa.
E limpe a solução de agente em excesso em torno dele. Observe e fotografe a amostra imediatamente sob um microscópio iluminado equipado com uma câmera de CCTV. Podemos processar e analisar quantitativamente as imagens fotografadas para área, acesso longo ou curto, e arredondamento de células, grânulos de amido e corpos proteicos em diferentes regiões para o kernel usando software de análise de morfologia.
Estabelecemos um método simples de secção seca para reter seções de tamanho de kernel inteiros na resina branca LR. O método pode preparar seções transversais e longitudinais de todo o kernel com dois mícrons. ou exemplos, toda a semente madura do estupro da oleosa pode ser seccionada transversalmente e longitudinalmente.
As seções de um núcleo integral maduro de milho com maior volume também podem ser preparadas com sucesso. Além disso, o kernel em desenvolvimento, o kernel cozido e o kernel germinado também podem ser investigados usando o método. As seções preparadas de núcleos inteiros têm as aplicações abaixo.
Primeiro, as seções do grão inteiro podem ser usadas para observar a estrutura tecidual das sementes. Por exemplo, as seções de embrião inteiro de estupro de oleosa manchadas com safranin podem claramente exibir que é um radical, hiper casual, interno e externo As seções de todo o kernel podem ser usadas para observar e analisar a morfologia das células. Por exemplo, as seções transversais de todo o embrião de estupro de oleosa são manchadas com brilho fluorescente 28, e os óleos celulares são manchados especificamente.
A micro-morfologia das células em qualquer região de embrião inteiro pode ser exibida em alta ampliação. Os parâmetros de morfologia das células parenchímicas podem ser analisados quantitativamente usando software de análise de morfologia e mostrar algumas diferenças em diversas regiões do embrião. As seções transversais de todo o núcleo de milho manchado com brilho fluorescente 28 também podem ser exibidas como uma morfologia das células, e os parâmetros de morfologia das células são diferentes em diversas regiões do endosperma.
seções de kernel inteiro podem ser manchadas com solução de iodo para exibir sua morfologia de grânulos de amido, por exemplo, as seções transversais e longitudinais de grãos de milho manchados com iodo podem exibir claramente sua morfologia de grânulos de amido. Os grânulos de amido em diversas regiões mostram morfologia, tamanho e quantidade significativamente diferentes em células endosperma. Assim, a análise quantitativa dos parâmetros morfológicos dos grânulos de amido mostra que eles são significativamente diferentes em diversas regiões para endosperma.
As seções podem ser usadas para observar e analisar a morfologia dos corpos proteicos. Por exemplo, a proteína do amido é manchada de azul usando Coomassie azul brilhante R250. A distribuição espacial da proteína amido em todo o embrião de estupro de oleosa pode ser observada em sua baixa ampliação, e a micro estrutura pode ser exibida claramente em alta ampliação.
Além disso, os parâmetros de erro numinese dos números dos corpos proteicos nas regiões escolhidas também podem ser analisados quantitativamente. Esta técnica fornece a primeira e simples preparação de seções de resina de grãos inteiros a partir de sementes desenvolvidas e maduras. As aplicações seccionais na estrutura tecidual de todo o kernel e, em seguida, investigando a morfologia das células, grânulos de amido, e os corpos proteicos em diferentes regiões de um núcleo inteiro.
As imagens adquiridas podem ser analisadas quantitativamente para mostrar os parâmetros de morfologia das células, grânulos de amido e corpos proteicos e compará-las em diferentes regiões de todo o kernel.
