Este método pode ajudar a esclarecer os mecanismos espinhais subjacentes à transmissão sensorial, regulação nociceptiva e desenvolvimento de dor crônica ou dor A principal vantagem dessa técnica é que ela pode permitir a preservação neuronal ideal e pode imitar condições in vivo até certo ponto. Comece puxando eletrodos de gravação de microcapillarias de vidro borossilicato usando um puxador capilar. Em seguida, encha um molde com ágar derretido para preparar um 1,2 centímetro por 1,5 centímetro por bloco de ágar de 2,0 centímetros.
Corte o bloco para ter um canal central se planejar seções transversais. Ou uma carne de canal com a borda do bloco para seções parasagitais. Antes da profusão transcárdia e extração da medula espinhal, prepare 500 mililitros de ACSF à base de sacarose.
Esfrie a solução para gelo frio e equilibre com 95% O2 e 5%CO2. Esfrie todas as ferramentas de dissecção no gelo. Faça uma incisão longitudinal de cinco centímetros na pele traseira de caudal a rostral.
Em seguida, corte a caixa torácica entre a coluna e as costelas de ambos os lados. Use uma tesoura para fazer um corte na extremidade caudal da coluna. Em seguida, corte os tecidos circundantes e isole rapidamente o segmento lumbosacral da coluna vertebral.
Transfira o segmento lumbosacral para um prato de vidro contendo sacarose gelada à base de CASF. Com o lado ventral para cima, use uma tesoura fina para cortar o pedículo vertebral bilateralmente e expor a medula espinhal cuidadosamente. Isole uma seção de dois centímetros de comprimento da medula espinhal com o alargamento lumbosacral e transfira a seção espinhal para outro prato de vidro cheio de sacarose fria ACSF.
Trabalhe sob um microscópio de dissecção para remover as meninges e a membrana aracnoide pia. Corte todas as raízes ventral e dorsal o mais rápido possível. Tome cuidado para evitar a lesão na medula espinhal, especialmente o chifre dorsal ao remover as meninges e as raízes espinhais.
Coloque a medula espinhal no bloco de ágar previamente aparado. Para preparar fatias transversais, conecte o lado ventral da medula espinhal ao ágar com o lado dorsal em direção à lâmina. Para preparar fatias parasagitais, conecte o lado ventral com supercola ao ágar em uma direção vertical.
Em seguida, monte o bloco de ágar em uma plataforma de vibratome com supercola. E prepare fatias transversais ou parasagitais de 300 a 500 mícrons com uma velocidade avançada de 0,025 milímetros por segundo e uma frequência de vibração de 80 Hertz. A medula espinhal deve ser cortada dorso-ventrally.
Para os melhores resultados, a fatia deve ser preparada dentro de 15 a 20 minutos. A espessura da fatia espinhal não deve ser superior a 600 mícrons para satisfazer a visibilidade celular. Use uma pipeta de plástico aparada para transferir as fatias para a malha de nylon em uma câmara de armazenamento contendo ACSF continuamente oxigenado a 32 graus Celsius.
Para realizar gravações de grampos de remendo de células inteiras a partir de neurônios de croseto ou SG de substantia, use soluções intracelulares baseadas em íons de potássio para gravação, aplicando solução baseada em cáção de césio apenas para o registro de correntes inibitórias pós-sinápticas. Mova suavemente a fatia da medula espinhal para a câmara de gravação. E, em seguida, estabilizá-lo firmemente com um fio de platina em forma de U com fios de nylon para a estabilidade da fatia ideal.
Profuse firmemente a fatia com ACSF borbulhado à temperatura ambiente e coloque a taxa de profusão em dois a quatro mililitros por minuto para obter oxigenação suficiente. Em seguida, usando uma lente de microscópio de baixa resolução, identifique a região dos neurônios SG como uma banda translúcida. Escolha um neurônio saudável, caracterizado por uma forma tridimensional com uma membrana brilhante e lisa como a célula alvo usando o objetivo de alta resolução e ajustá-lo ao centro da tela do monitor de vídeo.
Encha uma micro pipeta com um volume apropriado de solução intracelular baseada em íon de potássio ou íon de alumínio. Em seguida, insira a micro-pipeta no suporte do eletrodo e certifique-se de que a solução intracelular esteja entrando em contato com o fio de prata dentro do suporte. Coloque a micro pipeta em foco e use o micromanipulador para imergi-la no ACSF.
Aplique uma leve pressão positiva para afastar qualquer sujeira e detritos. Mova gradualmente a micro pipeta em direção ao neurônio alvo. Uma vez que a pipeta se aproxime do neurônio e uma covinha muito pequena se forma na membrana neuronal, libere a pressão positiva para formar um gigaseal.
Alterar o potencial de exploração para menos 70 milvolts, que é próximo do potencial fisiológico de membrana de descanso de uma célula. Em seguida, aplique uma sucção transitória e suave à micro pipeta para romper a membrana e criar uma boa configuração de células inteiras. Regisma propriedades de disparo testando o padrão de disparo de cada neurônio no grampo atual com uma série de um segundo despolarizando pulsos de corrente de 25 a 150 picoamps com incrementos de 25 picoamp no potencial de membrana de repouso.
Para registrar correntes subtenente somáticas, mantenha o potencial da membrana a menos 50 milvolts no modo de fixação de tensão e aplique uma série de pulsos de tensão hiperpolarising de uma segunda duração de menos 60 milivolts a menos 120 milvolts com um decremento de 10 milvolt. Registre correntes pós-sinápticas excitatórias com a solução intracelular baseada em íon de potássio no modo de fixação de tensão com um potencial de retenção de menos 70 milivolts. Registre IPSC usando solução intracelular baseada em íons de celulose para gravação de IPSC's.
Depois de segurar o potencial da membrana a menos 70 milivolts por aproximadamente cinco minutos, altere gradualmente o potencial de retenção para zero milvolts. Aguarde alguns minutos para estabilizar e comece a registrar os eventos do IPSC. Padrões de disparo determinados injetando uma série de pulsos de corrente despolarizantes de um segundo em um neurônio SG com potencial de membrana de repouso podem ser classificados como disparo tônico, disparo atrasado, disparo de lacunas, explosão inicial, estouro ático, pico único e disparo relutante.
Esta imagem mostra o protocolo de evocação para correntes de subtenências no grampo de tensão. Esses traços representativos mostram a resposta à injeção de corrente hiperpolarizadora classificada como IH, IA e TI. Este é um traço representativo de SEPSC registrado a partir de neurônios SG a menos 70 milvolts na ausência e presença de 50 APV micromolar e 20 cnqx micromolar. Este traço mostra os SEPC gravados antes da adição de APV e CNQX em uma escala de tempo expandida.
Após este procedimento estão os métodos como gravações de grampo de remendo emparelhado ou optogenética pode ser realizado para responder a perguntas adicionais como caracterizar microcircuitos neuronais específicos na gelatinosa substantia.
