この方法は、感覚伝達、ノシシ化調節および慢性疼痛または痛みの発達の基礎となる脊髄機構を明らかにするのに役立つこの技術の主な利点は、理想的な神経保存を可能にし、ある程度インビボ状態を模倣できることである。キャピラリープーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスマイクロキャピラリから記録電極を引っ張ることによって開始します。次に、溶融寒天で金型を充填し、1.2センチメートル、1.5センチメートル、2.0センチメートル寒天ブロックを調製します。
横断断面を計画する場合は、ブロックをトリムして中央チャネルを作成します。またはパラサジタルセクションのためのブロックの端を持つチャネル肉。経心筋拡散および脊髄抽出に先立ち、ショ糖ベースのACSFを500ミリリットル調製する。
氷冷に溶液を冷却し、95%O2と5%CO2で平衡化します。氷の上のすべての解剖ツールを冷却します。尾口から鼻の皮膚に長手方向の5センチの切開を行います。
その後、両側の背骨と肋骨の間の肋骨ケージを切り取ります。はさみを使って背骨の尾端で切り傷を作ります。その後、周囲の組織を切り取り、脊椎の腰仙セグメントを素早く分離します。
氷冷ショ糖ベースのACSFを含むガラス皿に腰部セグメントを移します。腹側を上向きに、細かいはさみを使用して椎骨のペディクルを両側で切断し、脊髄を慎重に露出させます。腰部肥大で脊髄の2センチメートルの長い部分を分離し、冷たいショ糖ACSFで満たされた別のガラス皿に脊髄セクションを移す。
解剖顕微鏡で、髄膜とピアくも膜を除去する。すべての腹側と裏側の根をできるだけ早く切り取ります。髄膜や脊髄を取り除くときに脊髄、特に後角の損傷を避けるように注意してください。
以前にトリミングした寒天ブロックに脊髄を置きます。横切りスライスを準備するには、脊髄の腹側をブレードに向かって背骨側で寒天に取り付けます。パラサジタルスライスを準備するには、腹側にスーパーグルーを付けて寒天を垂直方向に取り付けます。
その後、スーパーグルーでビブラートメのプラットフォームに寒天ブロックをマウントします。そして、毎秒0.025ミリメートルの高度な速度と80ヘルツの振動周波数で300〜500ミクロン横またはパラサジタルスライスを調製します。脊髄はドーソ腹腔内にスライスする必要があります。
最良の結果を得るには、スライスを15〜20分以内に準備する必要があります。細胞の可視性を満たすために、脊髄スライスの厚さは600ミクロン以下でなければなりません。プラスチック製のトリミングされたピペットを使用して、32°Cで連続的に酸素化されたACSFを含む貯蔵室のナイロンメッシュにスライスを移します。
実質的なゼラチン系またはSGニューロンからの全細胞パッチクランプ記録を行うために、シナプス後の抑制電流の記録に限り、セシウムカチオンベースの溶液を適用しながら、記録用のカリウムイオンベースの細胞内溶液を使用します。脊髄スライスを記録チャンバーにそっと動かします。そして、最適なスライス安定性のためにナイロン糸を持つU字型のプラチナワイヤーでしっかりと安定させます。
室温で気泡したACSFでスライスを着実に使い過ぎ、十分な酸素化を達成するために1分間に2〜4ミリリットルの拡散速度を設定します。次に、低解像度の顕微鏡レンズを用いて、SGニューロンの領域を半透明帯として同定する。高解像度の目的を使用して、ターゲットセルとして明るく滑らかな膜を持つ3次元形状を特徴とする健全なニューロンを選択し、ビデオモニタ画面の中央に合わせて調整します。
マイクロピペットに適切な量のカリウムイオンベースまたはセシウムイオンベースの細胞内溶液を充填します。次に、マイクロピペットを電極ホルダーに挿入し、細胞内溶液がホルダーの内側の銀線に接触していることを確認します。マイクロピペットを焦点に持ち込み、マイクロマニピュレータを使用してACSFに浸します。
汚れや破片を強制的に取り除くために、穏やかな陽圧を適用します。徐々に標的ニューロンに向かってマイクロピペットを移動します。ピペットがニューロンに近づき、ニューロン膜上の非常に小さなディンプルが形成されたら、正圧を放出してギガシールを形成します。
細胞の生理学的な静置膜電位に近いマイナス70ミリボルトに保持電位を変更します。その後、膜を破裂し、良好な全細胞構成を作成するために、マイクロピペットに一過性で穏やかな吸引を適用します。静止膜電位で25ピコアンプインクリメントを有する25〜150ピコアンプの一連の1秒の脱分極電流パルスを有する電流クランプ内の各ニューロンの発火パターンをテストすることによって、発射特性を記録する。
体細胞サブしきい値電流を記録するには、電圧クランプモードで膜電位をマイナス50ミリボルトで保持し、10ミリボルトのデクリメントでマイナス60ミリボルトからマイナス120ミリボルトまでの一連の超分極電圧パルスを1秒の持続時間に適用します。マイナス70ミリボルトの保持電位で、電圧クランプモードでカリウムイオンベースの細胞内溶液を用いた興奮性シナプス後電流を記録します。IPSCを記録するために、セルニア細胞内ソリューションを使用してIPSCを記録します。
膜電位をマイナス70ミリボルトで約5分間保持した後、徐々に保持電位をゼロミリボルトに変更する。安定化を待ってから、IPSC イベントの記録を開始します。一連の1秒の脱分極電流パルスを静止膜電位でSGニューロンに注入することによって決定される発火パターンは、強壮性焼成、遅延焼成、ギャップ焼成、初期バースト、フェジックバースト、単一スパイクおよび消極的な発火に分類され得る。
この図は、電圧クランプのサブしきい値電流の呼び出しプロトコルを示しています。これらの代表的なトレースは、IH、IAおよびITに分類される過分極電流注入に対する応答を示す。これは、50マイクロモルAPVおよび20マイクロモルCNQXの不在および存在下でマイナス70ミリボルトでSGニューロンから記録されたSEPSCの代表的な痕跡である。このトレースは、拡張タイムスケールに APV および CNQX が追加される前に記録された SEPC を示しています。
この手順に従って、ペアパッチクランプ記録や光遺伝学のような方法は、実質的なゼラチン系における特定の神経微小回路の特徴付けのような追加の質問に答えるために行うことができる。
