Agradecemos o apoio financeiro da Fundação Whitehall. Gostaríamos de agradecer Samuel T. Kissinger pelos valiosos comentários.

1. Configuração do sistema <ol><li> Construa a unidade de controle de pressão. <ol><li> Monte a unidade de controle de pressão de acordo com o mapa de circuitos ( Figura 1 ). Solde as peças necessárias na placa de circuito impresso (PCB) fabricada de acordo com os esquemas do circuito elétrico ( Figura 1b ). Use resistências padrão, LEDs, Transistores de Efeito de Campo-Óxido de Metal-Óxido (MOSFETs), capacitores e conectores (veja a Tabela de Materiais ). Solde as válvulas de solenóide na PCB. Conecte a bomba de ar e o sensor de pressão de ar à PCB com fio elétrico. NOTA: Deve demorar cerca de 2 h para construir a unidade de controle de pressão com todas as peças necessárias disponíveis. </li></ol></li><li> Conecte a placa de aquisição de dados secundária (DAQ). <ol><li> Conecte as saídas de dados da placa de circuito impresso à placa DAQ, seguindo a Tabela 1 . NOTA: A placa DAQ iráEu estou correndo em &quot;Modo single-ended&quot;. O mapa de portas pode ser encontrado no manual do usuário (veja a Tabela de Materiais ). </li><li> Conecte &quot;AIn Pr S&quot; a um dos canais de entrada analógica (AI) e &quot;R-Gr&quot; a um dos motivos analógicos na placa DAQ secundária. </li><li> Conecte a saída primária do amplificador a um dos canais AI e o chão ao solo analógico da placa DAQ secundária. NOTA: Um cabo BNC padrão pode ser usado para conectar a saída primária do amplificador. </li><li> Tire a outra extremidade e conecte o sinal positivo ( ou seja, o núcleo de cobre) ao canal AI e ao solo ( ou seja, o fio fino ao redor do núcleo) ao solo analógico. Repita esta etapa para um segundo canal se for utilizado mais de um canal de patch. NOTA: A entrada analógica para a placa DAQ será configurada em etapas posteriores. </li><li> Conecte a alimentação à saída de energia da placa DAQ secundária. Use uma energia separada de 12 V paraPara a bomba. </li></ol></li><li> Conecte a tubulação. <ol><li> Conecte a bomba de ar e as duas válvulas de acordo com a Tabela 2 . Use um conector de 3 vias para conectar a tubagem macia da porta superior da válvula 2, do sensor de pressão e do suporte da pipeta na última etapa. </li><li> Adicione outro conector de 3 vias à tubulação conectada ao suporte da pipeta se forem usadas duas pipetas. Alternar manualmente entre as válvulas e as pipetas em uso ao corrigir. </li></ol></li><li> Instale o Autopatcher IG. NOTA: Requisito do sistema: O Autopatcher IG só foi testado em um PC com o Windows 7. Não foi validado para outros sistemas operacionais. O procedimento descrito aplica-se especificamente ao hardware listado na Tabela de Materiais. <ol><li> Faça o download do Autopatcher-IG do GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG). </li><li> Instale o Python (veja a Tabela de Materiais para a versão e o endereço de download). </li><li> Desinstale o PyQt4Biblioteca digitando &quot;pip desinstalar PyQt4&quot; em um terminal de linha de comando. NOTA: O sistema usa uma versão mais antiga da biblioteca PyQt4 para obter compatibilidade com as bibliotecas Qwt e Opencv. </li><li> Instale bibliotecas Python a partir de arquivos de roda históricos (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Encontre os seguintes arquivos: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) e Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl). <ol><li> Para instalar os arquivos de roda, vá para o diretório onde os arquivos são salvos e digite &quot;pip install *** wheelfilename ***. Whl&quot;. Substitua &quot;*** wheelfilename ***&quot; com o nome real do arquivo. NOTA: &quot;cp27&quot; no nome do arquivo da roda indica Python 2.7 e &quot;win32&quot; indicou Windows 32-bit. Se &quot;win32&quot; não funcionar, tente &quot;win64&quot;. </li></ol></li><li> Para controlar a câmera CCD, baixe e instale o instaladorPara 64 bits (https://www.qimaging.com/support/software/). Em seguida, baixe o MicroManager para 64 bits (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) para controlar a câmera em Python. </li><li> Para controlar os manipuladores e o estágio do microscópio, instale o software de controle fornecido pelo fabricante. NOTA: Ao fazer isso, o driver necessário para controlar os manipuladores também está instalado. O pacote de instalação geralmente é fornecido em um CD-ROM. </li><li> Para controlar a placa DAQ secundária, instale a Biblioteca Universal a partir do CD-ROM, com a compra da placa DAQ. </li></ol></li><li> Configure o hardware para Autopatcher IG. <ol><li> Conecte os controladores do palco do microscópio e do manipulador ao computador via portas USB. </li><li> Atribua números de porta COM à unidade 0: etapa do microscópio, unidade 1: manipulador esquerdo e unidade 2: manipulador direito, nesta ordem, no arquivo de configuração &quot;ports.csv&quot; na pasta &quot;configuração&quot;. euEave os outros parâmetros no arquivo ports.csv ( ou seja, &quot;SCI&quot; ​​e &quot;1&quot;) inalterados. NOTA: As informações do número da porta COM podem ser encontradas executando o software de configuração do manipulador fornecido pelo fabricante. Vá para a guia &quot;configurações&quot;, selecione &quot;configurações&quot; e a página &quot;Movimento&quot;, e leia as etiquetas para cada guia na parte superior. Alternativamente, esta informação pode ser encontrada no PC Device Manager. </li><li> Atribua números de canais de entrada analógicos na placa DAQ para um sensor de pressão e canal de parches 1 e 2 (correspondente às unidades 1 e 2). Digite o número do canal no arquivo &quot;DAQchannels.csv&quot; na pasta &quot;configuração&quot;. NOTA: Recomenda-se abrir os arquivos .csv com o aplicativo Notepad em vez de uma planilha, pois pode alterar as informações ao salvar as alterações. </li></ol></li><li> Execute o Autopatcher IG. <ol><li> Ligue o amplificador, controlador de microscópio e controlador de manipulador. EnsuRe que o software do amplificador está funcionando. </li><li> Execute Autopatcher IG com Python a partir de um terminal de linha de comando da seguinte maneira: primeiro, altere o diretório (comando &quot;cd&quot; para os terminais mais comuns) onde Autopatcher IG está instalado, digite &quot;python Autopatcher_IG.pyw&quot; no terminal da linha de comando e pressione o botão &quot;Tecla Enter. NOTA: Não execute o software de controle do manipulador antes de executar o Autopatcher IG porque ele ocupará o estágio do microscópio e manipulador, fazendo com que o Autopatcher IG não consiga encontrar o hardware. O software de controle do manipulador pode ser executado depois que o Autopatcher IG é totalmente iniciado se houver módulos adicionais a serem controlados ( por exemplo, o aquecedor em linha). </li></ol></li><li> Calibre a pipeta primária. <ol><li> Puxe as pipetas de remendo como descrito anteriormente 9 . Preencha uma pipeta de vidro puxada com solução interna e carregue-a na fase principal. NOTA: as pipetas de vidro vazias têm diferentes contrastesO microscópio e pode levar a uma calibração imprecisa. </li><li> Mova a ponta da pipeta para o campo visual do microscópio e coloque-a no foco. Se o teclado de discagem for usado para mover os manipuladores e / ou o estágio do microscópio, atualize as coordenadas pressionando &quot;z&quot; no teclado. NOTA: Esta ação não é necessária se o teclado (etapa do microscópio: A / D - eixo x, eixo W / S-y, eixo R / F-z; manipuladores: H / K - eixo x, U / O eixo J-Y, O / L - eixo z, número de 1/2 unidade) é usado para controlar o movimento porque as coordenadas serão atualizadas em tempo real. </li><li> Clique no botão &quot;Iniciar calibração&quot; na interface gráfica do usuário principal (GUI) para a unidade correspondente na qual a pipeta está carregada ( Figura 2 ). NOTA: Uma janela pop-up aparecerá quando a calibração estiver concluída. NOTA: A calibração será realizada automaticamente, o que levará cerca de 3,5 min. Clicando no mesmo botão (comutado agora para &quot;cancelar calibração&quot; afCalibração iniciadora) abortará a tentativa de calibração. </li><li> Salve a calibração clicando em &quot;Salvar calibração&quot; na parte inferior da GUI principal (economiza a calibração atual para ambos os manipuladores e pode ser carregada no futuro). NOTA: O campo de exibição sob ampliação baixa (4 ou 10X) e alta (40X) deve ser alinhado para que a calibração secundária funcione corretamente. Consulte o manual do usuário do sistema óptico em uso para os procedimentos de alinhamento. </li></ol></li></ol> 2. Procedimento automático de grampeamento de patch <ol><li> Prepare fatias cerebrais agudas, como descrito anteriormente 10 . </li><li> Prepare pipetas de vidro para o grampo de patch. </li><li> Coloque uma fatia de cérebro no centro da câmara de gravação. Estabilize a fatia com uma fatia de retenção ou &quot;harpa&quot;. </li><li> Detectar a célula fluorescente. <ol><li> Encontre a área de interesse sob a lente 4X. Mova a fase do microscópio ativando o cliModo ck-to-move (&quot;CTM&quot;) e clique no centro da área de interesse. Alternativamente, use o teclado para mover o estágio do microscópio (A / D - eixo dos x, eixo W / S-y, eixo R / F-z). </li><li> Mude para a lente de alta ampliação e ajuste o foco movendo o microscópio no eixo z, usando R / F no teclado. NOTA: Recomenda-se ajustar o nível do banho de água para que o plano focal sob as lentes de alta e alta ampliação seja o mesmo ou similar no eixo z. </li><li> Clique no botão &quot;Detectar célula&quot; na coluna GUI principal, &quot;Unidade 0.&quot; Se o LED ou a fonte de luz laser da configuração não puderem ser controlados pelo sinal TTL, ligue manualmente o LED / laser; Uma janela pop-up aparecerá quando a detecção da célula estiver concluída. <ol><li> Desligue o LED / laser, se necessário; Uma lista de coordenadas de célula aparecerá na GUI de &quot;posições de memória&quot;. Remova as células indesejadas da lista clicando no botão &quot;X&quot; ao lado das coordenadas. </li><li>Alternativamente, se as células-alvo não estiverem rotuladas de forma fluorescente, clique em &quot;Modo do mouse&quot; na GUI principal. Clique na célula de interesse; Um ponto amarelo com um número aparecerá na célula, e as coordenadas da célula aparecerão na GUI das &quot;posições de memória&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Calibre a pipeta secundária. <ol><li> Preencha 1/3 de uma pipeta de vidro com solução interna. Coloque a pipeta no suporte da pipeta anexada ao estágio da cabeça. </li><li> Use a lente de baixa ampliação. Traga a pipeta para o campo visual e ajuste o foco usando o teclado (H / K - eixo x, eixo U / J - y, eixo O / L - Z). Use &quot;1&quot; e &quot;2&quot; para alternar entre a unidade 1 ea unidade 2. </li><li> Carregue a calibração primária clicando em &quot;Carregar calibração&quot;. Clique no botão &quot;Calibração secundária&quot; na GUI principal sob a unidade que está em uso. Por exemplo, se a unidade 2 estiver em uso, clique no botão &quot;Calibração secundária&quot; no &quot;Unidade 2&quot; coLumn. Siga as instruções da janela pop-up para alternar para a lente de alta ampliação. </li></ol></li><li> Remova uma célula alvo. <ol><li> Verifique se o software &quot;MultiClamp&quot; ( ou seja, amplificador) está sendo executado. Clique no botão &quot;Patch Control&quot; para abrir a GUI &quot;Patch Control&quot;; Pode demorar até alguns minutos para abrir esta GUI. </li><li> Use a lente de ampliação 40X, verificando &quot;40X&quot; na coluna GUI principal &quot;Unidade 0&quot;. Clique no botão &quot;ir para&quot; ao lado da célula de interesse na lista de coordenadas na GUI da &quot;posição de memória&quot;; O microscópio se moverá para a célula. </li><li> Clique no botão CTM da unidade em uso na GUI principal para ativar o movimento após o clique do mouse. Clique na célula de interesse; A ponta da pipeta vai se mover para a célula. </li><li> Clique no botão &quot;Patch&quot; na GUI &quot;Patch Control&quot;. NOTA: Parágrafo automático começará, e a pressão e a resistência podem ser monitoradasA GUI &quot;Patch Control&quot;. <ol><li> Use o botão &quot;Unidade 1 selecionada&quot; para alternar o sinal de entrada entre as duas unidades. NOTA: O sistema abordará a célula alvo, aplicará pressão negativa, combinará o potencial da membrana celular e detectará a formação de gigasea com base em uma série de limiares e lógica de pressão e resistência. </li><li> Manipule o processo automático em qualquer ponto clicando nos respectivos botões na GUI &quot;Patch Control&quot;. Por exemplo, clique no botão &quot;Patch&quot; novamente para cancelar o teste do patch e clique em &quot;Próxima etapa&quot; para avançar o processo de correção para o próximo passo, independentemente do limite. NOTA: Uma janela pop-up notificará o usuário quando um gigaseal se formou, e a opção de aplicar zap juntamente com grande pressão negativa será apresentada. </li></ol></li><li> Selecione &quot;Sim&quot; para entrar com zap combinado e sucção. Alternativamente, selecione &quot;Não&quot; para entrar apenas com sucção. <br/&gt; NOTA: Quando um patch completo de células inteiras for concluído, uma janela pop-up lembrará o usuário de salvar o log de patch da experiência. </li><li> Salve o log de patch do experimento. NOTA: se um teste de patches não for bem sucedido, uma janela pop-up notificará o usuário e o processo de patch será reiniciado. </li><li> Volte para a etapa 2.4 e repita as etapas com uma célula diferente. </li></ol></li><li> Refinar os limites de patches (opcional). NOTA: Limiares para a faixa inicial de resistência à pipeta, pressão positiva e negativa, resistência gigaseal, etc. Pode ser modificado a partir de um arquivo de configuração. <ol><li> Abra o arquivo &quot;PatchControlConfiguration.csv&quot; na pasta &quot;Configuração&quot; no destino onde o sistema está instalado. Altere os números correspondentes a cada valor de limiar. Não altere os nomes dos valores; Isso resultará em entradas irreconhecíveis no sistema. </li><li> Implementar os novos valores de limiar imediatamente pressionando &quot;CtRl + L &quot;sem reiniciar o programa; o reinício do programa implementará o valor de limiar mais recente do arquivo. </li></ol></li></ol> 3. Realizar gravações NOTA: O modo no amplificador de microeletrodos controlado pelo computador será ajustado automaticamente para a Clamp atual (&quot;IC&quot;) pelo software autopatcher uma vez que um patch bem-sucedido tenha sido alcançado. As gravações de grampos de patch de células inteiras podem ser feitas usando o software de gravação de eleição (este sistema não inclui uma função de gravação). Se várias células alvo foram identificadas, depois de terminar uma gravação, volte para o passo 2.4 e tente outra célula. <ol><li> Execute experimentos de aplicação de medicamentos locais automáticos usando um picospritzer (opcional). NOTA: Aqui, um experimento de aplicação de medicamento local é usado como um exemplo para descrever como usar a função adicional de &quot;seqüência de comando&quot; para controlar hardware externo através de sinais TTL. <ol><li> Conecte a porta A chaNnel 0 e o chão na placa DAQ secundária para a entrada de disparo inicial no digitalizador usando um cabo BNC despojado (conforme descrito no passo 1.2.3). Conecte um canal de saída digital no digitalizador ao gatilho externo no picospritzer. </li><li> Prepare o picospritzer de acordo com o manual do usuário. Conecte a saída de ar de picospritzer ao suporte de pipeta de droga-puff anexado a um micromanipulador. </li><li> Carregue uma pipeta preenchida com uma droga de escolha. Anexe-o ao titular da pipeta. Calibre a pipeta, conforme descrito no passo 1.7. </li><li> Depois de corrigir uma célula conforme descrito no passo 2.6, selecione um local desejado para entrega de drogas clicando com o mouse na GUI de visualização da câmera em &quot;modo mouse&quot; (comutação da GUI principal). Alternativamente, use a GUI &quot;Grid&quot; para projetar uma grade, com cada pixel na grade como um dos locais alvo. NOTA: A grade pode ser manipulada na GUI de visualização da câmera arrastando com o mouse. </li><li> No comando &quot;SequGUI, selecione a unidade de manipulação em que a pipeta do medicamento está montada. Clique em &quot;carregar pontos do mouse&quot; ou &quot;carregar pontos da grade&quot; para importar todas as coordenadas para a entrega do medicamento. <ol><li> Clique em cada entrada de coordenadas para editar o sinal TTL do comando específico na coluna da direita. Na primeira entrada do comando, clique no dígito mais à direita para ativá-lo de &quot;0&quot; a &quot;1&quot;, enviando um sinal TTL de + 5-V. Defina o tempo (T) para a duração desejada do sinal TTL, em ms. </li><li> Na segunda entrada de comando, ajuste todos os dígitos para &quot;0&quot; e ajuste T para a duração do tempo de gravação do teste. Edite comandos para todas as entradas de coordenadas. Adicione entradas de comando clicando em &quot;+&quot; se forem necessários vários sinais TTL. NOTA: Os bits de 8 dígitos representam os canais da porta A 0-7 no DAQ secundário (as portas 1 a 3 são ocupadas pela bomba e duas válvulas) podem ser comutadas, se necessário. </li></ol></li><li> Crie um protocolo de gravação no módulo de aquisição de dados paraQue o início de uma varredura é desencadeado pelo gatilho de início externo. Edite o protocolo para entregar o medicamento no horário desejado. </li><li> Na GUI do &quot;Sequência de Comando&quot;, clique em &quot;Executar&quot; à esquerda para executar todas as coordenadas. Alternativamente, clique em &quot;Executar&quot; à direita para executar apenas a seqüência selecionada. NOTA: A pipeta se moverá para cada coordenada e executará o sinal TTL conforme definido para iniciar a varredura de gravação. </li></ol></li></ol>

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Um pedido de patente não provisório &quot;SISTEMAS E MÉTODOS PARA A ELECTROFISIOLOGIA DE PATCH-CLAMP PATCH GUIADA AUTOMÁTICA EM VITRO&quot;, US Número de Série: 15 / 353.719, foi arquivado em 16 de novembro de 2016, Ref. No.: PRF 67270-02.

Aqui, descrevemos um método para gravações automáticas de grampos de patch guiados por imagem in vitro . Os passos principais neste processo estão resumidos da seguinte forma. Primeiro, a visão computacional é usada para reconhecer automaticamente a ponta da pipeta usando uma série de imagens adquiridas através de um microscópio. Esta informação é então utilizada para calcular a função de transformação de coordenadas entre o microscópio e os sistemas de coordenadas do manipulador. A visão computacional é usada para detectar automaticamente células com marcação fluorescente e identificar suas coordenadas. Essas etapas são integradas com a segmentação por pipeta e o algoritmo de patches automático usando a linguagem de programação Python, PyQT e OpenCV de código aberto. Em comparação com os métodos atuais de grampeamento in vitro , este sistema faz melhorias significativas nas diversas áreas. Isso minimiza a intervenção humana. Este sistema automatiza a maioria das etapas no experimento de grampo de patch, minimizando o reqNecessidade de intervenção humana. Algumas das etapas manuais restantes, incluindo a mudança entre as lentes de microscópio de baixa ou alta ampliação, podem ser automatizadas usando hardware motorizado adicional. O método patch-clamp melhora o rendimento. As experiências de patch-clamp usando este sistema alcançaram maiores taxas de sucesso e tempos mais curtos para cada teste, contribuindo para um aumento significativo no throughput global. O algoritmo de visão por computador para detecção de células fluorescentes e detecção de ponta de pipeta é muito robusto e a taxa de erro foi muito baixa. O erro médio para a detecção da ponta da pipeta foi de 1,6 μm ea taxa de falso positivo para detecção de células fluorescentes foi de 4,9% ± 2,25%. Uma comparação detalhada entre patch manual tradicional e patch automático foi feita 6 . A documentação detalhada dos experimentos é possível. Os logs de parches de cada teste podem ser salvos e analisados post hoc . Tais detalhesA documentação não estava disponível anteriormente para o patch manual. Isso permite a análise sistemática de experimentos de remendos em condições experimentais únicas, tipos de células, espécies e preparações em fatia. Este método mostra compatibilidade com o equipamento de grampo de patch in vitro padrão. Nosso sistema, conforme demonstrado neste manuscrito, é projetado para aumentar as plataformas existentes de grampeamento in vitro , proporcionando-lhes capacidade para realizar parches automáticos. Ao contrário da abordagem do patch plano, este sistema é adequado para laboratórios que já realizam o aperto manual de patch para converter seus equipamentos com um custo mínimo. Ao mesmo tempo, ainda existe a opção de patch manual ou semi-automático usando o mesmo sistema. Devido à adaptabilidade do sistema mencionado acima, a conexão do hardware e a configuração do software são exigidas pelo experimentador quando o sistema é configurado pela primeira vez. Podem ocorrer problemasDe atribuição de porta incorreta e bibliotecas de drivers inadequadas para o controle de determinado hardware. Consulte as etapas 1.2 - 1.4 quando a solução de problemas. Comparado com a automação parcial de sistemas existentes, este sistema atinge o nível máximo de automação no bloqueio convencional de patch in vitro de fatias agudas de cérebro (e outras preparações in vitro ). Isso é verdade para todas as etapas, desde a detecção de células até a calibração de pipeta até o patch 7 , 11 . O único gargalo é o processo manual de preenchimento e alteração das pipetas patch entre trilhas. Desenvolvimentos recentes na reutilização de pipetas patch podem potencialmente resolver esse problema 12 . Além da qualidade da preparação da fatia, a razão mais comum para os ensaios mal sucedidos é originada por erros mecânicos do manipulador e pelo movimento da fatia na câmara. Essas limitações estão além do nosso controle nasistema atual. Estão sendo feitos esforços para implementar detecção e controle de movimento de pipeta em tempo real, em tempo real, para responder a esse problema. Para o desenvolvimento futuro, estamos interessados ​​em expandir as capacidades atuais de detecção de células fluorescentes para a detecção geral de células sob a ótica DIC.

A técnica de grampos de parches foi desenvolvida pela primeira vez por Neher e Sakmann na década de 1970 para estudar os canais iônicos de membranas excitáveis 1 . Desde então, o aperto de patch foi aplicado ao estudo de vários assuntos diferentes a nível celular, sináptico e de circuito - tanto in vitro como in vivo - em vários tipos de células diferentes, incluindo neurônios, cardiomiócitos, oócitos Xenopus e lipossomas artificiais 2 . Este processo envolve a identificação correta e a segmentação de uma célula de interesse, o controle intrincado de micromanipulador para mover a pipeta de remendo próxima à célula, a aplicação de pressão positiva e negativa para a pipeta no momento adequado para estabelecer um patch gigaseal apertado, E uma invasão para estabelecer uma configuração de patch de células inteiras. O aperto do patch normalmente é conduzido manualmente e requer treinamento extensivo para dominar. Mesmo para um pesquisador com o patchClamp, a taxa de sucesso é relativamente baixa. Mais recentemente, várias tentativas foram feitas para automatizar experiências de patch-clamp. Duas estratégias principais evoluíram para realizar a automação: aumentando o equipamento padrão de grampo de patch para fornecer controle automático do processo de correção e o design de novos equipamentos e técnicas desde o início. A estratégia anterior é adaptável ao hardware existente e pode ser usada em uma variedade de aplicações de grampos patch, incluindo grampos de patch cegos in vivo 3 , 4 , 5 , grampo de patch in vitro de fatias de cérebro agudo, culturas de fatia organotípicas e neurônios dissociados cultivados 6 . Ele permite a interrogação de circuitos locais complexos usando múltiplos micromanipuladores simultaneamente 7 . O método de patch planar é um exemplo da nova estratégia de desenvolvimento, que pode atingir o alto desempenho simultâneo pBraçadeira de grampo de células em suspensão para fins de triagem de drogas 8 . No entanto, o método de patch plano não é aplicável a todos os tipos de células, particularmente neurônios com processos longos ou circuitos intactos contendo conexões extensas. Isso limita sua aplicação ao mapeamento dos intrincados circuitos do sistema nervoso, que é uma vantagem fundamental da tecnologia tradicional de grampos de patch. Desenvolvemos um sistema que automatiza o processo de grampeamento manual in vitro , aumentando o hardware padrão de grampos de parafusos. Nosso sistema, Autopatcher IG, fornece calibração automática de pipeta, identificação de alvo de célula fluorescente, controle automático de movimento de pipeta, patches automáticos completos e registro de dados. O sistema pode adquirir automaticamente múltiplas imagens de fatias de cérebro em diferentes profundidades; Analise-os usando a visão por computador; E extrair informações, incluindo as coordenadas de células com marcação fluorescente. Esta informação pode então serUsado para segmentar e corrigir automaticamente células de interesse. O software está escrito em Python - uma linguagem de programação livre e de código aberto - usando várias bibliotecas de fonte aberta. Isso garante a sua acessibilidade a outros pesquisadores e melhora a reprodutibilidade e o rigor das experiências de eletrofisiologia. O sistema possui um design modular, de modo que o hardware adicional pode ser facilmente interagido com o sistema atual demonstrado aqui.

<table width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:115px;">QImaging</td>
			<td style="width:147px;">Rolera Bolt</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="width:231px;height:101px;">Electrophysiology rig</td>
			<td style="width:115px;">Scientifica</td>
			<td style="width:147px;">SliceScope Pro 2000</td>
			<td style="width:256px;">Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &#8220;Linlab2&#8221;.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Amplifier</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:256px;">computer-controlled microelectrode amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Digitizer</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">Axon Digidata 1550</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="width:231px;height:55px;">LED light source</td>
			<td style="width:115px;">Cool LED</td>
			<td style="width:147px;">pE-100</td>
			<td style="width:256px;">488nm wavelength</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td height="98" style="width:231px;height:98px;">Data acquisition board</td>
			<td style="width:115px;">Measurement Computing</td>
			<td style="width:147px;">USB1208-FS</td>
			<td style="width:256px;">Secondary DAQ. 
			See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Solenoid valves</td>
			<td style="width:115px;">The Lee Co.</td>
			<td style="width:147px;">LHDA0531115H</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pump</td>
			<td style="width:115px;">Virtual industry</td>
			<td style="width:147px;">VMP1625MX-12-90-CH</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pressure sensor</td>
			<td style="width:115px;">Freescale semiconductor</td>
			<td style="width:147px;">MPXV7025G</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Slice hold-down</td>
			<td style="width:115px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:147px;">64-1415 (SHD-40/2)</td>
			<td style="width:256px;">Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Python</td>
			<td style="width:115px;">Anaconda</td>
			<td style="width:147px;">version 2.7 (32-bit for windows)</td>
			<td style="width:256px;">https://www.continuum.io/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:231px;height:20px;">Screw Terminals</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:115px;height:41px;">Sparkfun</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:147px;height:41px;">PRT - 08084</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:256px;height:41px;">Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">(2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">N-Channel MOSFET 60V 30A</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM - 10213</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-07937</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Red 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09590</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Green 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09592</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-12748</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">Wall Adapter Power Supply - 12VDC 600mA</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">TOL-09442</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="159">
			<td height="159" style="width:231px;height:159px;">Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-11367</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">Locking Male x Female X Female Stopcock</td>
			<td style="width:115px;">ARK-PLAS</td>
			<td style="width:147px;">RCX10-GP0</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="width:231px;height:77px;">Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td>
			<td style="width:115px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-171-129</td>
			<td style="width:256px;">Outer Diameter: 1/8 in. 
			Inner Diameter: 1/16 in.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">BNC male to BNC male coaxial cable</td>
			<td style="width:115px;">Belkin Components</td>
			<td style="width:147px;">F3K101-06-E</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td>
			<td style="width:115px;">Radioshack</td>
			<td style="width:147px;">2711116</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:115px;">General Valve</td>
			<td style="width:147px;">Picospritzer II</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

O grampo de patch de células inteiras é o método padrão de ouro para medir as propriedades elétricas de células isoladas. No entanto, o grampo de patch in vitro continua a ser uma técnica desafiadora e de baixo débito devido à sua complexidade e alta dependência da operação e controle do usuário. Este manuscrito demonstra um sistema de grampo de correção automático guiado por imagem para experiências in vitro de grampos de grampos de células inteiras em fatias agudas do cérebro. Nosso sistema implementa um algoritmo baseado em visão computacional para detectar células marcadas com fluorescência e direcioná-las para o patch totalmente automático usando um micromanipulador e controle de pressão interna da pipeta. Todo o processo é altamente automatizado, com requisitos mínimos para a intervenção humana. As informações experimentais em tempo real, incluindo a resistência elétrica e a pressão interna da pipeta, são documentadas eletronicamente para análise futura e para otimização para diferentes tipos de células. Embora o nosso sistema seja descrito no contexto do brai agudoN grava gravações, também pode ser aplicada à braçadeira automatizada de patch guiada por imagem de neurônios dissociados, culturas de fatias organotípicas e outros tipos de células não neuronais.

<html> Nosso sistema foi testado em sua capacidade de remendar células em fatias agudas do cérebro, células tumorais pluripotentes induzidas por mouse (iPSCs) diferenciadas em neurônios e células HEK 293 que expressam artificialmente canais de interesse. A Figura 3 mostra uma experiência utilizando ratinhos transgênicos Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) visando os neurônios piramidais da camada 5 marcados fluorescentemente no córtex visual. A célula-alvo foi uma das células positivas fluorescentes verdes identificadas automaticamente ( Figura 3b ). A Figura 3a é a imagem de Contraste de Interferência Diferencial (DIC) do neurônio remendado. A configuração da célula inteira foi alcançada pelo protocolo de remendo automático nas etapas 2.5 - 2.6 e foi validada por potenciais de ação induzidos por injeção de corrente de passo ( Figura 3c ) 1 &quot;&gt; Para demonstrar a função adicional&quot; Seqüência de comando &quot;, entregamos KCl 500 mM por 200 ms para três locais em uma fatia de cérebro enquanto faz o patch de uma célula ( Figura 4 ). Primeiro, selecionamos 3 locais na fatia do cérebro: um fechado Para o corpo da célula remendada e dois longe da célula remendada. As coordenadas foram armazenadas na GUI das &quot;Posições de Memória&quot;. As coordenadas foram carregadas na GUI &quot;Sequência de Comandos&quot; sob &quot;Unidade 1&quot;, que foi o manipulador que o KCl- A colocação da pipeta foi montada. Configuramos os comandos na coluna esquerda para enviar um sinal TTL de +5 V para 500 ms, seguidos de 0 V para 10 s ( Figura 4a ), da porta A do canal 0 na placa DAQ secundária, Que foi conectado à entrada do &quot;gatilho de inicialização&quot; do digitalizador. A Figura 4c mostra que a célula remendada era um neurônio de spiking normal. A pipeta do aplicativo de drogas (Unidade 1) atravessava os três locais selecionados aUtomaticamente ( Figura 4b ), e gravamos 10 s para cada aplicação sob tensão-grampo ( Figura 4d ). A cor dos traços na Figura 4d corresponde à cor da borda na Figura 4b . Quando KCl foi inchado na célula, observou-se uma grande corrente interna, que diminuiu lentamente à medida que o KCl se difundiu. O corante fluorescente vermelho foi adicionado à solução de KCl para indicar a distribuição espacial da administração de fármaco e foi imaginado usando DIC combinada e imagem epifluorescente. Este experimento ilustrou a facilidade e flexibilidade do nosso sistema para controlar o movimento manipulador / microscópio e hardware externo através de sinais TTL. <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig1.jpg" /> Figura 1. Unidade de controle de pressão. A: placa de circuito impresso (PCB) para conexão das válvulas, pressãoSensor e bomba de ar. A esquerda mostra detalhes na PCB, rotulando locais de saídas que são mencionados no protocolo. A direita mostra a conexão entre a PCB e a bomba de ar, porta USB e tubulação. B: mapa de circuito para a PCB. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig2.jpg" /> Figura 2. Autopatcher GUI. Os botões mencionados no protocolo são mostrados em quadrados vermelhos e são numerados. 1: Iniciar Calibração, 2: Salvar Calibração, 3: Calibração de carga, 4: Calibração secundária, 5: Detectar célula, 6: Controle de patch, 7: Ir para (coordenada da célula alvo) e 8: Patch. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura</a>. <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig3.jpg" /> Figura 3. Um Exemplo da Célula positiva com ChR2-YFP Patched. A: ampliação 40X em óptica DIC. B: Imagem de epifluorescência da mesma célula no painel A (iluminação LED a 488 nm). C: Gravação de grampos atuais da célula remendada durante uma série de injeções de hipertensão hiperpolarizante e despolarizante. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig4.jpg" /> Figura 4. Realização de uma experiência automatizada de entrega de medicamentos. A: locais selecionados carregados na GUI do &quot;Seqüência de comando&quot;. A coluna da esquerda mostraA lista de coordenadas e a coluna da direita mostram a lista de comandos sob a forma de sinais TTL para cada local. B: Capturas de tela durante a experiência do aplicativo de drogas correspondente aos três locais selecionados. A unidade 1 era a pipeta contendo KCl e a unidade 2 era a pipeta de remendo. A solução de KCl foi misturada com corante fluorescente vermelho para fins de visualização. As imagens foram obtidas combinando DIC e imagens de fluorescência. C: Injeções atuais de passo mostrando um neurônio de spiking regular. D: traços de gravação de tensão-fixação da aplicação local de solução de KCl 500 mM em três locais. O traçado vermelho com corrente interna foi gravado a partir do teste quando o aplicativo KCl estava próximo da célula remendada. A seta vermelha indica o tempo da aplicação KCl. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1"Fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Saída na PCB </td><td> Nome da porta na placa DAQ </td><td> Port # na placa DAQ </td><td> Observação </td></tr><tr><td> DOUT V1 </td><td> Porto A canal 1 </td><td> 22 </td><td> Válvula de controle 1 </td></tr><tr><td> DOUT V2 </td><td> Porto A canal 2 </td><td> 23 </td><td> Válvula de controle 2 </td></tr><tr><td> DOUTO P </td><td> Porto A canal 3 </td><td> 24 </td><td> Bomba de ar de controle </td></tr><tr><td> Gr </td><td> Terra </td><td> 29 </td><td> Terra </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Placa de circuito impresso (PCB) para configuração de conexão de placa de aquisição de dados secundária (DAQ). Use esta tabela para conectar as saídas PCB (primeira coluna da esquerda) às portas na placa DAQ (segunda coluna da esquerda). O nome e o número da porta no DAQ secundário referem-se ao modo de uma única extremidade. <img alt="mesa 2" src="/files/ftp_upload/56010/56010table2.jpg" /> Tabela 2. Conexões de tubos da Unidade de Controle de Pressão para o (s) titular (es) de pipeta. Para cada conexão, conecte as portas correspondentes, realçadas com uma caixa cinza, usando tubos macios (veja a Tabela de Materiais ).

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Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Este protocolo descreve como conduzir experimentos de grampos-grampos guiados por imagem usando um sistema desenvolvido recentemente para equipamentos de eletrofisiologia padrão in vitro .

Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K visualizações.  Purdue University.  Este protocolo descreve como conduzir experimentos de grampos-grampos guiados por imagem usando um sistema desenvolvido recentemente para equipamentos de eletrofisiologia padrão in vitro . 

Vídeo: Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Cultura e Eletrofisiologia de células em NRCC patch-clamp-Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Neurociência

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

Aplicação local de Drogas para estudar a função do receptor nicotínico de acetilcolina no cérebro do rato Fatias

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento de neurônios sensoriais de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.