Geração de culturas de tecido de pulmão humano de 3D (3D-CTIs) para modelagem de doença

Este método permite a investigação do tecido humano vivo em sua estrutura 3D natural e composição para a tradução dos principais achados laboratoriais em terapias potenciais. Esta técnica permite especificamente a geração de culturas teciduais a partir de tecido pulmonar cirurgicamente ressectado ou explanado para a visualização de amostras de tecido pulmonar de pacientes falecidos individuais. O tecido pulmonar livre de doenças pode ser usado como culturas teciduais 3D para modelar doenças pulmonares ex vivo permitindo a análise de mecanismos precoces em uma alta resolução espacial.

Comece colocando a amostra pulmonar resseccionada em 15 mililitros de meio de cultivo em um prato de cultura estéril de 15 centímetros e bandeja de metal estéril coberta de papel de tecido, e encha uma seringa de 30 mililitros com 42 graus Celsius de baixo ponto de fusão. Remova o obturador de um cateter venoso periférico e conecte o cateter à seringa de 30 mililitros. Identifique um brônquio de 0,5 a 3 milímetros de diâmetro no tecido ventilativo em uma seção intacta do tecido, e insira suavemente a cânula em brônquios o mais longe possível.

Use fórceps para comprimir a parede de brônquio ao redor da cânula, idealmente fixando qualquer artéria pulmonar adjacente ao mesmo tempo, para selar os brônquios ao redor da cânula e usar um grampo cirúrgico para ocluir quaisquer outras vias aéreas adicionais, para evitar o vazamento de agarose. Em seguida, use os fórceps para levantar o tecido pulmonar do prato de cultura, e use a seringa para entregar manualmente a agarose através da cânula, não mais rápido que 0,3 mililitros por segundo. Quando o tecido pulmonar estiver completamente preenchido sem inflar demais o tecido, remova imediatamente a cânula e aperte o brônquio.

Submergir o tecido em meio de cultura a quatro graus Celsius por 30 minutos para facilitar a solidificação da ágarose, e repetir o procedimento de enchimento de agarose para quaisquer aberturas adicionais de brônquio. Em seguida, armazene as seções de tecido pulmonar recheadas em quatro graus Celsius médio até cortar. Para cortar o pulmão de precisão, identifique as regiões solidamente cheias de agarose dentro do tecido pulmonar, que não entram em colapso quando suavemente pressionadas com pinças contra o fundo do prato de cultura celular.

Extite um bloco de 1 a 1,5 centímetro cúbico de região solidamente preenchida com um lado ainda coberto de pleura, e use cola cianoacrilato para anexar o lado plural de cada bloco de tecido ao suporte de vibratome. Corte todo o caminho através do bloco de tecido longo, até que apenas dois a três milômetros de tecido são deixados sem corte. Utilização de fórceps para transferir cada seção de 500 micrômetros para um poço de uma placa de doze poços contendo meio de cultivo, como são obtidos.

Quando todo o tecido tiver sido seccionado, transfira as amostras de cada poço em pratos individuais de cultura de dez centímetros e posicione um perfurador de biópsia de quatro milímetros ortogonalmente para a superfície superior da fatia pulmonar cortada com precisão. Em seguida, movendo o perfurador em rotações no sentido horário e anti-horário, obtenha socos teciduais da amostra pulmonar. Colocando cada soco em meio de cultura celular fresca em poços individuais de uma placa de 96 poços à medida que são obtidos.

Quando todos os socos teciduais tiverem sido obtidos, coloque a placa na incubadora de cultura celular por até cinco dias. A imunolacção da fibronectina nos núcleos celulares usando a Imunofluorescência em culturas humanas de tecido pulmonar 3D permite a imagem da estrutura alveolar preservada ex vivo. O tratamento dos golpes de corte de precisão humana com um coquetel de citocina profibrotic por 48 horas resulta em alterações semelhantes à fibrose nas culturas de tecido 3D do pulmão humano, incluindo a indução significativa dos componentes da matriz extracelular relevante da fibrose, colágeno Tipo Um e genes de fibronectina.

Além disso, os níveis proteicos da vimentina marcador mesenquimal são regulados em três dos quatro pacientes após o tratamento de socos da cultura do tecido pulmonar 3D. Após esse procedimento, outros métodos como a análise de RNA por PCR quantitativo em tempo real, ou análise de proteínas por mancha ocidental, podem ser realizados para avaliar a expressão genética e proteica, respectivamente, dentro do tecido. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo da pneumologia experimental, para explantar a biologia pulmonar, bem como para realizar estudos toxicológicos e farmacológicos em amostras de tecido humano.

Lembre-se que o tecido humano vivo é potencialmente infeccioso e que medidas de precaução, como o uso de equipamentos de proteção individual e armazenamento adequado de tecidos, transporte e manuseio de resíduos, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento