Este método fornece uma ferramenta importante no campo da modificação proteica, permitindo a geração fácil e eficiente de conjugados de anticorpos. As principais vantagens dessa técnica são a facilidade de manuseio, o alto rendimento da produção de anticorpos, a velocidade da reação de psicodisão e a estabilidade da ligação formada. Inicie este procedimento com células de suspensão HEK crescentes, conforme descrito no protocolo de texto.
Quando a densidade de 2,5 milhões de células por mililitro for atingida, prepare uma nova solução do derivado ciclopropeno de liseina, ou CpK, em 1 hidróxido de sódio molar. Adicione 2,5 mililitros de CpK ao meio de expressão complementado com antibióticos. Misture bem a solução e adicione 250 microliters de um HCl molar, depois esterilize a solução usando um filtro de 22 mícrons.
Agora centrífuga 125 milhões de células na densidade alvo por cinco minutos a 500 x g. Após a centrifugação, adicione a mistura de reagente de transfecção de DNA ao meio de expressão contendo CpK e use este meio para resuspensar as células. Seis a sete dias após a adição de CpK, colmeia o trastuzumabe com anticorpos CpK do supernante, centrifugando as células por 15 minutos a 3.000 x g.
Em seguida, filtrar o supernaspe. Agora adicione tampão de lavagem de contas 5x em tubos cônicos de 250 mililitros e misture com o sobrenante e adicione a proteína pré-aquilibrada A resina. Coloque o tubo cônico em um rolo por três horas à temperatura ambiente para puxar o anticorpo e o supernatante.
Após a incubação, transfira a proteína A resina com o sobrenante em uma coluna e permita que o líquido flua. Em seguida, adicione 25 mililitros de tampão de lavagem e deixe que isso flua. Adicione um mililitro de um tampão de fosfato molar, 150 mililitros de sódio ao tubo de coleta e elute o anticorpo com quatro mililitros de 1 citrato de sódio molar pH 3.
A solução ácida é imediatamente neutralizada à medida que sai da coluna pela solução básica já presente no tubo de coleta. Em seguida, diluir o anticorpo com 10 mililitros de PBS. Concentre o anticorpo em 5 a um mililitros por filtragem centrífuga e troque o buffer três vezes com PBS.
Purifique as amostras por FPLC usando uma coluna de interação hidrofóbica butil com zero a 100% de gradiente de tampão de sal baixo em alto tampão de sal ao longo de 30 minutos. Colete todas as frações e monitore a elução em 280 nanômetros. Concentre as frações que contêm anticorpos por filtragem centrífuga e troque o buffer três vezes com PBS.
O anticorpo pode então ser armazenado a quatro graus Celsius. Monometil auristatina E, ou MMAE, é altamente tóxico. Portanto, use luvas e óculos ao manusear derivados do MMAE.
Se você usar MMAE não modificado como controle, manuseie o produto sólido dentro de um capô de fumaça ao preparar a solução de estoque no MSO. Para conjugar o anticorpo com molécula de rolamento de tetrazina, dilui 10 equivalência molar de tetrazina MMAE por anticorpo com 20 microliters de acetonitrilo e 76 microliters de PBS em um pequeno tubo cônico. Adicione um molar equivalente de trastuzumabe com cpk.
Misture bem e deixe reagir por três horas à temperatura ambiente para formar trastuzumabe ligado ao MMAE. Moléculas que não sejam o MMAE potencialmente maiores e mais esticamente dificultadas podem estar ligadas ao anticorpo usando este protocolo. Adicione todo o volume da reação na coluna de giro e centrífuga a 1500 x g por um minuto.
Para analisar o conjugado, equilibre a coluna HPLC HIC com tampão de sal 100% alto por cinco minutos. Em seguida, misture 15 microliters de uma solução miligrama por mililitro de trastuzumab ligado ao MMAE com 15 microliters de tampão de sal de 2X de altura em um frasco. Injete a mistura na coluna HPLC.
Elute em um fluxo isocrático de um mililitro por minuto com tampão de sal 100% alto por um minuto. Siga-o com um gradiente de 15 minutos de 100 a zero por cento de tampão de sal alto em tampão de sal baixo. Monitore a elução a 280 nanômetros.
Integre os picos no cromatógrafo com tempos de retenção de 7,5, 9,2 e 11,5 minutos, que correspondem ao trastuzumabe com zero, uma e duas toxinas conjugadas, respectivamente. Agora, calcule o DAR somando as áreas dos picos em 9,2 minutos, que tem um peso de um, e 10,5 minutos, que tem um peso de dois, e divida pela área total dos três picos. Para analisar o conjugado por LC-MS, primeiro, deglycosilato 30 microlitres de um miligrama por mililitro ADC e o anticorpo não modificado em condições não redutoras usando 250 unidades de PNGase F por pelo menos seis horas a 37 graus Celsius.
Descongele o soro e filtre-o através de um filtro de 22 mícrons. Em seguida, encha os poços externos de uma placa de poço 96 com água. Nos poços centrais, misture em triplicado 90 microliters de soro com 10 microliters de um miligrama por mililitro trastuzumab tetramethylrhodamina em PBS a uma concentração final de 1 miligrama por mililitro.
Coloque a placa em uma incubadora saturada com umidade a 37 graus Celsius e 4% de CO2. A cada 24 horas ao longo de cinco dias, pipeta cada poço completamente para misturar e tomar uma alíquota de cinco microliter. Flash congele a alíquota com nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius.
Uma vez coletadas todas as amostras, descongele as alíquotas e analise usando uma ELISA indireta, conforme detalhado no protocolo de texto. Alternativamente, um kit ELISA comercial pode ser usado para medir a concentração da ADC. Dois dias antes do ensaio, encha os poços externos de uma placa de poço 96 com água.
Em seguida, levante as células com 05% de trippsina em 5 milimães EDTA. Centrifugar as células três minutos a 250 x g e resuspend em novo meio. Em seguida, semente 3.000 células em 100 microliters por poço em 96 placas de poço e colocá-los de volta na incubadora.
Dois dias após a semeadura das células, prepare diluições seriais de todas as amostras em triplicado com 1%DMSO em meio completo. Agora adicione 100 microliters de cada amostra em cada poço e incubar por cinco dias a 37 graus Celsius e 4% de CO2. No quinto dia, meça a viabilidade celular.
Para isso, use um kit comercial para lise as células e medir a ATP liberada. Plote a porcentagem de sinal em relação às células de controle tratadas com 1%DMSO. Os ADCs podem ser incubados a 37 graus Celsius durante cinco dias em soro e testados para citotoxicidade para provar a estabilidade funcional.
Um anticorpo com alça de ciclopropeno pode ser obtido usando este procedimento com rendimentos acima de 20 miligramas por litro após a purificação da proteína A. O anticorpo produzido pode ser rapidamente e especificamente conjugado ao local de uma toxina portadora de tetrazina. Após a conjugação do anticorpo com uma toxina, as relações médias entre drogas e anticorpos são maiores que 1,9, medida pela cromatografia de interação hidrofóbica.
A identidade da ADC é confirmada por espectrometria em massa. A ligação dihydropyridizene gerada é estável no soro humano por mais de cinco dias a 37 graus Celsius. O conjugado de anticorpos é potente e mata seletivamente células com altos níveis de HER2, em vez de células com baixos níveis de HER2.
Além disso, o anticorpo sem a toxina e a toxina modificada com o linker de tetrazina têm uma toxicidade muito baixa. A toxina por si só mostra uma toxicidade dependente não-HER2 destacando a necessidade de segmentação para alcançar a seletividade. Após este procedimento, podemos preparar rapidamente e eficientemente conjugados de anticorpos para o tratamento de tumores.
Potencialmente, qualquer droga funcionalizada com uma tetrazina pode estar ligada a qualquer anticorpo direcionado a um biomarcador de células cancerosas. As implicações dessa técnica se estendem a qualquer conjugado proteico destinado à terapia ou diagnóstico.
