이 방법은 단백질 변형 분야에서 중요한 도구를 제공하여 항체 약물 공물의 촉진적이고 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 취급의 용이성, 항체 생산의 높은 수율, 정신 작용 반응의 속도 및 형성된 연결의 안정성입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HEK 서스펜션 셀이 증가함에 따라 이 절차를 시작합니다.
밀리리터당 250만 개의 세포밀도가 도달하면, 수산화나트륨 1개에서 리신 또는 CpK의 사이클로프로펜 유도체의 신선한 용액을 준비한다. 항생제로 보충된 발현 매체에 CpK의 2.5 밀리리터를 추가합니다. 용액을 잘 섞고 하나의 어금니 HCl250 마이크로리터를 추가한 다음 22 마이크론 필터를 사용하여 용액을 살균합니다.
이제 원심 분리기 1억 2,500만 개의 세포가 500 x g에서 5분 동안 목표 밀도로 합니다. 원심분리에 따라, CPK를 함유하는 발현 배지에 DNA-트랜스퍼션 시약 혼합물을 추가하고 이 배지를 사용하여 세포를 재일시 중단한다. CpK를 첨가한 후 6~7일 후, 3, 000 x g에서 15분 동안 세포를 원심분리하여 상피품으로부터 CpK 항체를 베어링하는 트라스투주맙을 수확한다.
그런 다음 상체를 필터링합니다. 이제 250 밀리리터 원모형 튜브에 5배 의 비드 워시 버퍼를 추가하고 상체와 혼합하고 미리 보정된 단백질 A 수지를 추가합니다. 원문 튜브를 실온에서 3시간 동안 롤러에 놓고 항체와 상체를 끌어당깁니다.
인큐베이션에 이어, 단백질 을 트랜스넘비로 체상화된 수지컬을 컬럼으로 옮기고 액체가 흐르도록 한다. 그런 다음 25 밀리리터의 세척 버퍼를 추가하고 이를 통해 흐르도록 합니다. 1개의 어금니 인산염 완충제 1밀리리터, 150 밀리머 나트륨 염화나트륨을 수집 튜브에 넣고 1개의 굴어 나트륨 pH 3의 4밀리리터로 항체를 엘테.
산성 용액은 수집 튜브에 이미 존재하는 기본 용액에 의해 컬럼에서 벗겨지면서 즉시 중화됩니다. 다음으로, PBS의 10 밀리리터로 항체를 희석시. 항체를 원심 여과에 의해 5~1밀리리터로 농축하고 PBS로 완충제를 세 번 교환한다.
30분 이상 높은 염완충액에서 저염 버퍼의 0 내지 100% 그라데이션을 가진 부틸 소수성 상호작용 컬럼을 사용하여 FPLC에 의해 샘플을 정화합니다. 모든 분획을 수집하고 280 나노미터에서 용출을 모니터링합니다. 원심 여과에 의해 항체를 포함하는 분획을 농축하고 PBS로 완충제를 세 번 교환한다.
항체는 섭씨 4도에서 저장될 수 있습니다. 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 MMAE는 매우 독성이 있습니다. 따라서 MMAE 유도체를 취급할 때 장갑과 고글을 사용하십시오.
수정되지 않은 MMAE를 컨트롤로 사용하는 경우 MSO에서 스톡 솔루션을 준비할 때 연기 후드 내부의 고체 제품을 처리하십시오. 테트라진 베어링 분자로 항체를 결합하기 위해, 작은 원추형 튜브에 아세토닐릴20 마이크로리터와 PBS의 76 마이크로리터로 항체 당 테트라진 MMAE의 10개의 어금니를 희석시한다. CPK베어링 트라스투주맙과 동등한 1개의 어금니를 추가합니다.
철저하게 혼합하고 MMAE에 연결된 trastuzumab을 형성하기 위해 실온에서 3 시간 동안 반응 할 수 있습니다. MMAE 이외의 분자는 잠재적으로 더 크고 더 sterically 방해가 이 프로토콜을 사용하여 항체에 연결될 수 있다. 1분 동안 1500 x g의 스핀 컬럼과 원심분리기에 반응의 전체 볼륨을 추가합니다.
컨쥬게이트를 분석하려면 HPLC HIC 컬럼을 100% 높은 염전 버퍼로 5분간 상위화합니다. 그런 다음 MMAE에 연결된 trastuzumab의 밀리리터 용액 당 1밀리그램의 15 마이크로리터를 유리병에 2X 고염 완충제 15마이크로리터와 혼합합니다. 혼합물을 HPLC 컬럼에 삽입합니다.
1분 동안 100% 높은 소금 버퍼를 가진 밀폐식 1밀리리터의 엘루테. 낮은 소금 버퍼에서 높은 염완충제의 100에서 0 %까지 15 분 그라데이션으로 이 것을 따르십시오. 280 나노미터에서 용출을 모니터링합니다.
크로마토그램의 피크를 각각 0, 1, 2개의 접합독소로 trastuzumab에 해당하는 7.5, 9.2 및 11.5분의 고정 시간과 통합합니다. 이제 1의 무게를 가지고 9.2 분에 피크의 영역을 추가하고, 두 개의 무게를 가지고 10.5 분에 DAR를 계산하고, 세 봉우리의 총 영역으로 분할. LC-MS에 의해 컨쥬게이트를 분석하기 위해 먼저, 밀리리터 ADC당 1밀리그램의 30마이크로리터와 37°C에서 최소 6시간 동안 PNGase F 250단위를 사용하는 비환화 조건에서 수정되지 않은 항체를 탈수하게 한다.
혈청을 해동하고 22 미크론 필터를 통해 필터링합니다. 그런 다음 96 웰 플레이트의 외부 우물을 물로 채웁니다. 중앙 우물에서, 트리플리케이트 90 혈청의 마이크로 리터와 10 밀리리터 당 1 밀리그램의 마이크로 리터 PBS에서 1 밀리 그램의 최종 농도에서 밀리리터 당 1 밀리그램.
습도가 포화된 인큐베이터에 플레이트를 섭씨 37도, CO2 4%로 배치합니다. 5일 동안 24시간마다 파이펫을 잘 사용하여 5개의 마이크로리터 알리쿼시를 혼합하고 섭취합니다. 액체 질소로 알리쿼트를 얼리고 섭씨 80도에 보관하십시오.
모든 샘플을 수집하면 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 알리쿼트를 해동하고 간접 ELISA를 사용하여 분석합니다. 대안적으로, 상용 ELISA 키트는 ADC의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 분석 이틀 전에 96 웰 플레이트의 바깥 우물을 물로 채웁니다.
그런 다음 5 밀리모어 EDTA에서 05 %의 트립신으로 세포를 들어 올립니다. 250 x g에서 3 분 동안 세포를 원심 분리하고 새로운 배지에서 다시 중단합니다. 그런 다음 96 개의 우물 판에서 잘 당 100 마이크로 리터에 3, 000 세포를 씨앗하고 인큐베이터에 다시 배치합니다.
세포를 파종한 지 이틀 후, 전체 배지에서 1%DMSO로 트리플리케이트에 있는 모든 시료의 직렬 희석을 준비한다. 이제 각 샘플의 100 마이크로리터를 각 우물에 추가하고 섭씨 37도, CO2 4%로 5일간 배양합니다. 5일째에는 세포 생존가능성을 측정합니다.
이를 위해 상용 키트를 사용하여 세포를 lyse하고 방출된 ATP를 측정합니다. 1%DMSO로 처리된 제어 셀에 대하여 신호의 백분율을 플롯합니다. ADC는 혈청에서 5일 동안 섭씨 37도에서 배양할 수 있으며 기능적 안정성을 증명하기 위해 세포 독성에 대해 분석할 수 있습니다.
사이클로프로펜 손잡이를 가진 항체는 단백질 A 정화 후에 리터 당 20 밀리그램 이상의 수율을 가진 이 절차를 사용하여 얻을 수 있습니다. 생성된 항체는 테트라진을 베어링독소에 신속하고 구체적으로 공주할 수 있다. 독소와 항체의 결합시, 항체에 대한 평균 약물 비율은 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이 1.9보다 큽습니다.
ADC의 ID는 질량 분석법에 의해 확인됩니다. 생성된 디하이드로피리디젠 결합은 37°C에서 5일 이상 인간 혈청에서 안정적입니다. 항체 약물 공주는 HER2의 낮은 수준을 가진 세포보다는 HER2의 상부를 가진 세포를 강력하고 선택적으로 죽입니다.
더욱이, 테트라진 링커로 변형된 독소와 독소가 없는 항체는 독성이 매우 낮다. 독소만으로도 선택성을 달성하기 위해 타겟팅의 필요성을 강조하는 비HER2 의존독성을 나타낸다. 이 절차에 따라 종양 치료를 위해 항체 약물 컨쥬게이트를 신속하고 효율적으로 준비할 수 있습니다.
잠재적으로, 테트라진으로 기능화된 모든 약물은 암 세포 바이오마커를 표적으로 하는 항체에 연결될 수 있다. 이 기술의 의미는 치료 또는 진단을 위한 어떤 단백질 컨쥬게이트든지까지 확장됩니다.
